■ 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DH10Bac菌株是一種可以用于生產(chǎn)桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)所需的大分子質(zhì)粒DNA的克隆化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。DH10Bac菌株自身帶有兩個(gè)質(zhì)粒：攜帶桿狀病毒基因組的穿梭載體bMON14272和輔助質(zhì)粒pMON7124。后者介導(dǎo)bMON14272中的桿狀病毒基因組和即將外源轉(zhuǎn)入的表達(dá)載體(第三個(gè)質(zhì)粒)之間的位點(diǎn)特異性重組，產(chǎn)生的大分子質(zhì)粒DNA同時(shí)含病毒基因組和表達(dá)重組蛋白的基因，并能在DH10Bac菌株中高效擴(kuò)增。DH10Bac菌株bMON14272包含mini-F復(fù)制子、卡那霉素抗性基因、attTn7位點(diǎn)和lacZα互補(bǔ)因子；輔助質(zhì)粒pMON7124包含四環(huán)素抗性和tnsABCD區(qū)域，該區(qū)域表達(dá)轉(zhuǎn)座反應(yīng)所需的轉(zhuǎn)座蛋白。攜帶T7轉(zhuǎn)座原件(Tn7 element)的外源轉(zhuǎn)入的表達(dá)載體(通常為pFastBac)帶有慶大霉素抗性基因。因此可在卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素抗性的平板篩選陽(yáng)性克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提??；?80lacZΔM15的存在使DH10Bac可用于藍(lán)白斑篩選；mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。經(jīng)pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化檢測(cè)，DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108 cfu/μg DNA。

■ 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

● 高轉(zhuǎn)化效率：>1x108 cfu/µg pUC19 DNA
● 適合于生產(chǎn)桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)所需的大分子質(zhì)粒DNA

■ 產(chǎn)品組成

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124 

■ 存儲(chǔ)條件

-80℃保存；請(qǐng)勿將本品置于-20℃或者液氮中保存!

■ 產(chǎn)品應(yīng)用

DH10Bac菌株適合于生產(chǎn)桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)所需的大分子質(zhì)粒DNA。

■ 使用方法

1. 解凍感受態(tài)細(xì)胞：從-80 ℃取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化約5-10 min，然后立即進(jìn)行DNA樣品的轉(zhuǎn)化。

2. DNA樣品的轉(zhuǎn)化：每100 μL感受態(tài)可加入0.5-10 μL待轉(zhuǎn)化DNA樣品（例如質(zhì)粒、連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物等），然后輕輕彈擊管底約5-6次，立即冰上靜置孵育30 min。

• 待轉(zhuǎn)化DNA樣品的加入體積不宜超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10。

• 加入待轉(zhuǎn)化DNA樣品后應(yīng)輕柔彈擊混勻，避免使用移液槍劇烈吹打混勻。

• 用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)可將冰浴時(shí)間縮短至5-10 min；用于連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化時(shí)，建議冰浴時(shí)間為15-30 min以提高轉(zhuǎn)化效率。

3. 熱激處理：冰浴后，將裝有感受態(tài)和DNA樣品的的離心管快速置于42℃水浴中，靜置熱激90 s。隨后立即轉(zhuǎn)移至冰上靜置2-3 min以快速冷卻。

• 熱激時(shí)間需要精確控制在45-90 s。

• 熱激及轉(zhuǎn)移至冰浴過程中禁止晃動(dòng)離心管。

4. 復(fù)蘇培養(yǎng)：加入900 μL 室溫或37 ℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基（或SOC培養(yǎng)基等），上下顛倒數(shù)次混勻，然后將離心管傾斜放置在恒溫?fù)u床中，37℃ 220 rpm復(fù)蘇培養(yǎng)45 min。

• 37℃為常規(guī)復(fù)蘇溫度，若轉(zhuǎn)入質(zhì)粒對(duì)溫度敏感或其它特殊情況需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的溫度。

5. 收菌涂板：用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，復(fù)蘇后可直接取50-100 μL菌液涂板；用于連接產(chǎn)物或重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化時(shí)，建議先5000 g，1 min室溫離心，吸棄約900 μL上清，然后用剩余的約100 μL重懸菌液，涂布到含相應(yīng)抗生素的LB平板上。

6. 過夜培養(yǎng)：將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

• 培養(yǎng)前需要將平板在超凈臺(tái)中稍微晾至無明顯水漬，有利于形成單克隆。

• 37℃為常規(guī)培養(yǎng)溫度，若轉(zhuǎn)入質(zhì)粒對(duì)溫度敏感或其它特殊情況需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的溫度。

■ 相關(guān)參數(shù)