肉類顏色測量指南

肉色研究方法A-F

如何使用本節(jié)

本節(jié)詳細介紹了研究肌紅蛋白的常用方法。在多數(shù)情況下，研究人員可直接選用現(xiàn)有方法。若需根據(jù)特殊條件調(diào)整方法，則應(yīng)審閱相關(guān)研究文獻以確保方法的適用性。

與所有定量分析化學(xué)一樣，研究人員必須 對最終計算予以嚴格注意，特別是使用適當?shù)南庀禂?shù)，確定校正稀釋因子，并驗證方程式中的所有單位都消除了所需的測量單位。

協(xié)議索引

A. Prerigor Meat的pH

B. Postrigor肉或熟食的pH

C. 新鮮或煮熟肉類的總肌紅蛋白（以DMb計）

D. 新鮮或熟肉的總肌紅蛋白（等比點測定法）

E. 熟肉中亞硝基血紅素和總血紅素含量

F. 小樣本的亞硝基血紅素和總血紅素含量

G. 分離肌紅蛋白用于體外研究

H. 從牛骨骼肌中分離線粒體

I. 完整肌肉或碎肉的耗氧量

J. 完整或研磨肉的肌紅蛋白還原能力

K. 骨骼肌提取物對肌紅蛋白的還原作用

L. 檢測變性血紅蛋白血色素的反射率

M. 腌肉的亞硝酸鹽分析

N. 腌肉及配料硝酸鹽分析

O. TBARS 用于氧化性酸敗的快速濕法檢測

P. TBARS 氧化性酸敗的檢測方法——蒸餾法

A . Prerigor Meat的pH

原則：

在預(yù)冷肌肉中，pH會緩慢下降，因為糖酵解產(chǎn)生的乳酸會積累。為了確定死后特定時間的pH 值，會添加碘乙酸來抑制糖酵解（特別是甘油醛-3 - 磷酸脫氫酶）， 防止進一步產(chǎn)生 乳酸。

試劑：

1. 150 mM Potassium chloride=11.184 g/L

鉀溶液中配制 。 如需將溶液pH調(diào)至7 . 0，可用 幾滴0.1 N鹽酸或0.1 N*調(diào)節(jié)。

溶液應(yīng)保持新鮮（3°C下保存不超過3天）。分析前，溶液需自然升溫至室溫。使用前請檢查pH值。分析過程中，溶液需在攪拌板上持續(xù)攪拌，以確保獲得準確的pH值。

由于預(yù)冷混合樣品容易堵塞電極， pH計應(yīng)每4至5個樣品后用兩種標準緩沖液驗證其 準確性 ， 并在必要時重新校準 。

操作步驟：

1. 使用前用4.0和7.0緩沖液對pH計進行標準化。

2. 稱取10 g樣本肌肉組織放入攪拌杯中。

3. 向燒杯中加入100 mL的5 mM NaIAc和150 mM Potassium chloride。

4. 混合樣品30秒，或直至充分混合但未乳化。

5. 測量pH。

記下

確保電極清潔且響應(yīng)速度合理。

要獲得準確的肉類pH測量值，需要正確護理和清潔電極、代表性樣本采集以及樣本制備。

參考

Bendall，J. R. 1973 .肌肉的死后變化。

見《肌肉的結(jié)構(gòu)和功能》第2卷，G. H. Bourne編，Acad. Press，New York，NY，第243-309頁。

B. Postrigor肉或熟食產(chǎn)品的pH

操作步驟：

1. 使用前，用4.0和7.0緩沖液對pH計進行標準化。

2. 稱取10 g細碎樣品放入攪拌杯中。

3. 添加100 mL去離子水或蒸餾水。

4. 混合樣品30秒，或直至充分混合但未乳化。

5. 測量pH。

參考

Koniecko，E. S. 1979 .肉類化學(xué)家手冊。第53、54和62頁。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。

c. 新鮮或熟肉中肌紅蛋白總量（以DMb計）

原則

樣品粉碎

1. 將樣本切成小方塊（或采用方案D中的樣本制備方法）。

2. 將立方體浸入液氮中，直至液氮快速沸騰完成。

3. 向Waring攪拌器中加入少量液氮。

4. 將攪拌機開啟2至4秒，使其冷卻。攪拌機應(yīng)保持干燥，以免轉(zhuǎn)子結(jié)冰。

5. 將粉碎后的樣品傾倒在潔凈的紙張上，隨后用該紙張將樣品倒入Whirl-Pak袋中，盡可能去除空氣。

6. 將樣品存放在超低溫冷凍箱（-60 °C）中直至使用。

肌紅蛋白測定方法

1. 將兩份(2)10克的粉碎樣品稱重至Waring攪拌機碗中，并記錄每份樣品的精確重量。

2. 加入90 mL冷磷酸鉀緩沖液（0.04 M，pH 6.8）。稀釋因子為：90 mL + 10 g = 100/10 = 10 ×稀釋。

3. 將樣品混合1分鐘。

4. 將均勻混合的樣品部分轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，隨后置于0至4 °C 顏料浸提1小時。

注意，雖然混合樣品有100mL，但離心后僅需少量（3 mL）上清液（下面的步驟6）。

5. 在4°C下以15,000 × g 離心 樣品30分鐘 。

6. 將上清液收集于小燒杯中，取3 mL上清液通過0.4微米孔徑的注射器濾膜過濾，轉(zhuǎn)移至1 cm寬的分光光度計比色皿中進行澄清。

7. 向貯備液中加入亞硫酸氫鈉（見下文注釋），將樣品中的所有肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為DMb形式 。

8. 使用掃描分光光度計對樣品進行700至400 nm波長范圍的掃描，DMb的吸收峰應(yīng)位于433 nm和556 nm波長的±2 nm范圍內(nèi)。

記下

樣品中的所有肌紅蛋白必須為DMb形式。433 nm處的Soret峰是DMb的良好指示劑。

僅當掃描后出現(xiàn)的峰在433 nm的2 nm范圍內(nèi)時，才分析樣品。

如果峰在433 nm的2 nm范圍內(nèi)，則讀取433 nm處的峰吸光度。 使用以下公式計算總肌紅蛋白濃度 。

計算

1 M DMb溶液在433 nm波長下，于1厘米光程比色皿中的摩爾吸光系數(shù)（消光系數(shù)）為114,000/ M（Antonini和Brunori，1971）。牛肌紅蛋白的分子量為16.949 kDa，家禽肌紅蛋白為17.3 kDa（Joseph等人，2010a）。

因此，肌紅蛋白的分子量可取為平均值17 kDa。

記下

在肌紅蛋白氧化還原研究中，二硫代*用于將MMb還原為DMb，隨后再轉(zhuǎn)化為OMb。通常使用1：10的二硫代*與肌紅蛋白比例。

然而,有時可能需要更高用量。直接向肌紅蛋 白溶液中添加二硫代*粉末有時會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。為減少這種情況，可使用10%的二 硫代*儲備溶液來還原MMb。

對于每1 mL濃度為2.5 mg/mL的肌紅蛋白溶液，可添加并混合5微升10%的二硫代*。如有必要,可再添加5微升直至形成DMb。

這將增強二硫代 *在肌紅蛋白溶液中的混合效果，且不會導(dǎo)致肌紅蛋白顯著稀釋。二硫代*儲備溶 液必須儲存在棕色瓶中，4°C保存，并需每2至3天新鮮配制 。

對于因色素含量低或經(jīng)烹煮變性的樣本中肌紅蛋白濃度較低的情況，可通過添加少量K?[Fe(CN)?]將提取的色素轉(zhuǎn)化為高鐵肌紅蛋白。

需注意控制添加量，過量的氧化劑會使肌紅蛋白溶液呈現(xiàn)黃色，從而干擾吸光度測定。高鐵肌紅蛋白在409納米處具有非常強的索雷特峰（Bowen，1949），這使得檢測低濃度色素成為可能。在肌紅蛋白吸光度光譜中，索雷特峰通常具有峰值吸光度。

因此，稀釋因子的選擇需根據(jù)每個峰的具體特性、測試樣本中提取色素的含量 以及 光譜儀的峰值吸光度限制來確定。

在低氧MAP中，煮熟的牛排使用了0.11 L/10 g肉的稀釋因子。對于含有更多Mb的生樣品，離心后取1 mL 上清液，再用2 mL冷的0.04 M磷酸緩沖液（pH 6.8）在比色皿中進行稀釋（稀釋因子3 ： 1）。

將10克用高氧MAP（甲基丙烯酸酯）包埋的熟牛排樣本，用50毫升磷酸鹽緩沖液稀釋，稀釋倍數(shù)為0.06 L/10克肉（Hunt等，1999）。

參考文獻

安東尼尼，E.，和M.布魯諾里。 1971 。血紅蛋白和肌紅蛋白與配體反應(yīng)。荷蘭阿姆斯特丹北荷蘭。

Bowen，W. J. 1949. 肌紅蛋白的吸收光譜和消光系數(shù) . J. Biol. Chem. 179 ： 235 –245. Hunt，M. C.，O. S?rheim ，and E. Slinde. 1999. 肉末中肌紅蛋白形式的顏色和熱變性。 J. 食品科學(xué)64： 847 -851。

Joseph，P.，S. P. Suman，S. Li，C. M. Beach，and J. R. Claus. 2010a.火雞肌紅蛋白的質(zhì)譜表征和熱穩(wěn)定性。LWT -Food Sci. Technol. 43 ： 273 – 278 。

沃里斯，P.D. 1979 。鮮肉中血紅素色素的提取。食品技術(shù)雜志14： 75 -80。

D. 新鮮或熟肉中的總肌紅蛋白（等比點法測定）

原則

該程序（Faustman和Phillips，2001）與協(xié)議C非常相似。將所有形式的肌紅蛋白（DMb、OMb和MMb）提取至pH 6.8的0.04 M磷酸鹽緩沖液中（Warriss，1979）。

然而，與將色素轉(zhuǎn)化為特定氧化還原形式不同，總Mb濃度通過525 nm處的吸光度測定，這是肌紅蛋白三種形式的等峰點。需要注意的是，殘留的血液血紅蛋白也會被提取，并對總?cè)馍睾坑兴暙I。

試劑

流程

1. 將肉絞成1/8英寸厚的薄片，或絞成3毫米的方塊，或使用 協(xié)議C中的液氮法 。

2. 稱量5克重復(fù)肉樣，放入50毫升聚丙烯管中。

3. 每5克樣品加入25毫升冰鎮(zhèn)磷酸鹽緩沖液（pH 6.8,0.04 M）（Warriss，1979；Trout，1989）。稀釋因子為25毫升+5克=30毫升/5=6。

4. 使用聚丙烯管或類似探針式勻漿器的小直徑頭，以低速將樣本勻漿40至45秒。

5. 將樣本置于冰上（0至4℃）保存1小時。

通過加熱變性的Mb百分比 = [1?（加熱后Mb濃度÷加熱前Mb濃度）]×100（Trout，1989）。

參考文獻

Bowen ，W . J . 1949 .肌紅蛋白的吸收光譜和消光系數(shù)。 J . Biol . Chem .179：235– 245 .

Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測量. 《食品分析化學(xué)新協(xié)議》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。

Joseph，P.，S. P. Suman，S. Li，C. M. Beach，and J. R. Claus. 2010a.火雞肌紅蛋白的質(zhì)譜表征和熱穩(wěn)定性。

LWT -Food Sci. Technol. 43 ： 273 – 278 。

Trout，G. R. 1989. 肉紅蛋白變性及煮熟牛肉、豬肉、 和火雞肉顏色的變化受 pH、氯化鈉、三聚磷酸鈉和烹飪溫度的影響。J. Food Sci. 54： 536 。

沃里斯，P.D. 1979 。鮮肉中血紅素色素的提取。食品技術(shù)雜志14： 75 -80。

e. 熟肉中亞硝基血紅素與總血紅素含量

原則

精加工肉類色素的提取采用含80%丙酮和20%水的溶液（含樣品水分）進行（霍恩西，1956）。

色素含量（以血紅素原硝基化物ppm計） 根據(jù)樣品在540納米處的吸光度計算得出。 煙熏效率以 血紅素原硝基化物占總血紅素的百分比表示。研究表明，優(yōu)質(zhì)煙熏肉類中硝基血紅素占比通常超過80%（皮爾遜與陶伯，1984）。

另一種測定總血紅素的方法是使用酸化丙酮溶液，該溶液可提取所有血紅素蛋白 中的血紅素原（現(xiàn)統(tǒng)稱為血紅素原）。此時提取物中的血紅素原會轉(zhuǎn)化為血紅素（即血紅素原），其濃度可通過樣品在640納米處的吸光度計算得出。

記下

本試驗中提取的亞硝基血紅素色素 非常容易褪色 ，因此需要格外小心，使用還原照明和用箔紙覆蓋的容器來盡量減少光化學(xué)氧化。

亞硝基血紅素（熟肉色素）含量測定方法：

1. 稱重前，先切除脂肪組織，然后將瘦肉切成細末。完成所有步驟光線減弱后的后續(xù)步驟。

2. 取10克瘦肉末放入高腳100毫升燒杯中（以減少蒸發(fā)）。將瘦肉碎與43mL含有40mL丙酮和3mL水的溶液充分混合。

考慮到典型的10g肉樣含有7mL水， 提取溶液是80% 丙酮 ， 從而在不提取 DMB 、 OMb 或MMb 的情況下 （Hornsey ， 1956）定量提取大量的亞硝胺色素 。

3. 在弱光條件下，繼續(xù)對樣品進行5分鐘的間歇性混合。

4. 5分鐘后，用中速濾紙（Whatman #1或同等產(chǎn)品）過濾溶液，轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中。

5. 使用分光光度計測定濾液在特定波長下的吸光度（光密度）使用1厘米比色皿，波長540納米?？瞻讓φ帐褂?0%丙酮/20%水溶液。

計算NO-血紅素色素濃度

吸光度與輻射波長、吸收物質(zhì)的性質(zhì)及分子量密切相關(guān)。特定波長下的毫摩爾吸光度（符號E ）通過實驗測定獲得，即在1厘米比色皿中測定1 mM濃度溶液的吸光度。 80% 丙酮水溶液中 ，氧化態(tài)血紅素（NO-heme）在540 nm波長處的毫摩爾吸光度為11. 3（Hornsey ， 1956）。 血紅素分子量為652道爾頓 。

表達血紅素濃度時所需的換算系數(shù)（1ppm = 1 µg / g）以及稀釋系數(shù)也需考慮 。 稀釋系數(shù) 等于總萃取液體積（毫升）除以樣品重量（克）。 總萃取液體積包含樣品的水分含量 和乙醇水溶液的體積 。 大多數(shù)新鮮和 熟食肉類的水分含量約為70%。

因此，對于一 個含7毫升水的10克樣品，總萃取體積=7毫升水+43毫升乙醇溶液，稀釋系數(shù)= 50/10=5.0。若樣品水分含量與70%存在顯著差異，應(yīng)調(diào)整乙醇溶液的配比，使 萃取過程中乙醇水溶液的水分含量達到80%（Cornforth，2001）。

霍恩西將換算系數(shù)四舍五入為290。

總色素含量測定法

1. 將10克碎肉樣本（含70%水分）與40毫升丙酮、2毫升 水 和1毫升濃鹽酸 的溶液混合。這樣就得到一個80：20的丙酮 ： 水 比例溶液， 用于提取血紅素色素。對于水分含量低于70%的樣本，需添加足量水分，使提取混合物達到80：20的丙酮與水比例。

2. 在過濾前，將溶液在室溫下儲存并定期攪拌一小時。酸化萃取液可使新鮮和熟成肉色素中的血紅素基團轉(zhuǎn)化為酸性血紅素。 酸化丙酮溶液可從未熟成和熟成肉色素中萃取酸性血紅素形式的血紅素基團（DMb 、 OMb 、 MMb 、NO - Mb）（Hornsey ， 1956）。

3. 測定濾液在640 nm處的光密度（1 cm比色皿），以確定總血紅素色素含量。使用步驟1中的溶液（酸化80%丙酮溶液）作為空白對照。

4. 在總色素的估算中，可對512和處的吸收峰進行吸光度測定。640 nm。如果在酸化的80% 丙酮中 NO-血紅素氧化為酸性血紅素 是完成的 ，則比值應(yīng)小于1.9。 計算521 / 640 nm處的吸光度 ， 以驗證比值 < 9 。

5. 要以ppm表示總色素濃度，需將光密度值乘以640 nm by 680。

計算總色素濃度和固化效率

固化效率：將總顏料轉(zhuǎn)化為亞硝基顏料的百分比， 也可表示固化后顏色褪色的程度 。

參考文獻

霍恩西，H.C.1956.熟制風(fēng)干豬肉的顏色。上半部分：一氧化氮-血紅素色素的估算?！妒称放c農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志》。23:534–540.

Pearson，A. M.和F. W. Tauber. 1984.分析方法.第360-361頁，加工肉類.第二版.A. M. Pear son和F . W . Tauber ，編 .

AVI Publishing ，Westport ，CT .

小樣本的亞硝基血紅素和總血紅素含量

原則

Pearson和Tauber（1985）改進了Hornsey 的（1956）分析小樣本（2 - g）樣品的程序，減少了所需的試劑量，并增加了每天分析的樣品數(shù)量。將樣品置于帶蓋試管中，以防止蒸發(fā)。

試劑

1. 丙酮-a（丙酮水溶液）：將90 mL蒸餾水置于1 L容量瓶中，加入 分光光度級丙酮 ， 攪拌并定容 。

2. 丙酮-b（酸性丙酮）：緩慢將20mL濃鹽酸加入80mL水中。將稀釋的鹽酸溶液轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中,攪拌,并用額外的分光光度級丙酮定容 。

流程

1. 在弱光下進行所有操作，以減少色素褪色。

2. 取2.0克絞碎瘦肉樣本，置于50毫升聚丙烯離心管中稱重。

3. 向50毫升試管中加入9.0毫升丙酮，使丙酮濃度達到80%。

4. 用探針式均質(zhì)機或玻璃棒充分混合。

5. 蓋緊試管以盡量減少丙酮的蒸發(fā)，并輕輕旋轉(zhuǎn)混合。

6. 在黑暗中靜置10分鐘，然后用中速濾紙過濾到 玻璃試管 中。

7. 將 濾液轉(zhuǎn)移至1-cm石英比色皿中，并在540nm處讀取吸光度（避免使用一次性塑料比色皿，因為暴露于丙酮后會變得不透明）。按照之前所述方法計算亞硝基色素濃度。

8. 另取2.0 g樣品，用丙酮乙醇溶液處理。

9. 靜置1小時，然后過濾。

10. 按之前的方法對提取物進行過濾，并在640 nm處讀取吸光度。 按之前描述的方法 計算總色素

和固化效率。

參考文獻

Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測定。收錄于《食品分析化學(xué)現(xiàn)行實驗指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。

霍恩西，H.C. 1956. 熟制腌豬肉的顏色。I. 一氧化氮-血紅素色素的估計。J. Sci. Food Agric. 23 ： 534 –540。

皮爾遜，A. M.，和F. W. 塔伯。1984。分析方法。收錄于《加工肉類》第二版，第360–361頁。由A. M. 皮爾

遜和F. W. 塔伯編， AVI 出版社，康涅狄格州韋斯特波特。