肉類顏色測(cè)量指南

肌紅蛋白和肉色的研究

本指南中的大部分章節(jié)涉及視覺(jué)或分光光度分析。本節(jié)將重點(diǎn)介紹實(shí)驗(yàn)室分析，例如肌肉pH和肌紅蛋白濃度，這些分析有助于表征骨骼肌中的顏色化學(xué)?？赡苄枰~外閱讀文獻(xiàn)以正確應(yīng)用和解釋這些程序的數(shù)據(jù)。肌紅蛋白化學(xué)在第二節(jié)中進(jìn)行了總結(jié)，但許多其他肉類顏色和肌紅蛋白化學(xué)的綜述及書(shū)籍章節(jié)也有助于加深對(duì)這些程序的理解。本節(jié)描述了各種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和測(cè)量的程序，并隨后列出一個(gè)或多個(gè)推薦的分析方案。

A. 新鮮肉類研究

1. pH。 肉類pH可能是影響新鮮和熟肉顏色的最重要單一因素。因此，肉類顏色研究中應(yīng)報(bào)告pH值。當(dāng)pH從5.6增加到8.5時(shí)，肌紅蛋白氧化（及褐變）顯著受到抑制（Shikama和Sugawara，1978；Yin和Faustman，1993）。肉色素的溶解度也受到肉pH的顯著影響。因此，提取溶液被緩沖至pH6.8，以從肉樣中獲得肌紅蛋白和血紅蛋白高產(chǎn)量（Warriss ， 1979）。 

此外 ，在制備純化肌紅蛋白時(shí)，離心和透析步驟中使用pH8.0至8.5的緩沖溶液，以最小化肌紅蛋白氧化（Faustman和Phillips，2001）。烹飪過(guò)程中肌紅蛋白的變性在pH>6.0時(shí)也顯著降低（Trout，1989），這解釋了由高pH、深色切割牛肉制成的熟牛肉餅持續(xù)粉紅的現(xiàn)象（Moiseev和Cornforth，1999）。相反，當(dāng)pH降至5.5–5.7、牛肉餅在烹飪過(guò)程中過(guò)早變褐會(huì)增加，因?yàn)檩^低的pH有利于MMb的形成（Hunt等人，1999）。

第XI-A節(jié)推薦用于測(cè)量預(yù)僵化肉的pH值，使用碘乙酸抑制糖酵解并防止乳酸進(jìn)一步產(chǎn)生。第XI-B節(jié)推薦用于后僵化肌肉或熟肉制品。越來(lái)越多的研究人員還使用配備穿透性pH探頭的便攜式儀器測(cè)量單個(gè)肌肉的pH值。與所有pH測(cè)量一樣，該設(shè)備必須根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行校準(zhǔn)，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液。感興趣的pH范圍（通常為4.0至7.0）。校準(zhǔn)溶液應(yīng)處于或接近 實(shí)際樣品溫度 。

2. 新鮮肉類中的總色素含量。 肉類色素含量之所以備受關(guān)注，一方面與肉色深淺密切相關(guān)，另一方面從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度看，它能反映血紅素鐵的含量。肉類是重要的鐵質(zhì)來(lái)源，但不同形態(tài)的鐵元素在生物利用率和引發(fā)氧化反應(yīng)的潛力上存在差異。因此，準(zhǔn)確測(cè)定肉類中血紅素鐵與非血紅素鐵的含量可能具有重要價(jià)值（卡彭特 和克拉克，1995）。

染料提取和分光光度法（透射或吸收）是測(cè)定總肌紅蛋白和血紅蛋白濃度的優(yōu)選方法。第十一節(jié)-C描述了一種在pH 6.8的冷磷酸鹽緩沖液中提取肉類色素的方法（Warriss，1979）。 通過(guò)添加亞硫酸氫鈉將所有色素轉(zhuǎn)化為還原、去氧形式（Hunt等人，1999）。色素濃度通過(guò)去氧色素在433 nm（Soret峰）處的吸光度測(cè)定。第十一節(jié)-D描述了一種類似的在冷磷酸鹽緩沖液中提取肉類色素的方法，但總色素濃度通過(guò)525 nm處的吸光度測(cè)定，這是三種肌紅蛋白形式的等峰點(diǎn)。第十一節(jié)-D基于 Krzywicki（1979）的方法，經(jīng) Trout（1989）修改，并由Tang、Faustman和Hoagland（2004）進(jìn)一步改進(jìn)。

為測(cè)量肉表面肌紅蛋白形式的相對(duì)比例，推薦Tang等人（2004）的更新方法。然而，對(duì)于溶液中總色素濃度的測(cè)定，兩種方法可得出等效結(jié)果。Trout（1989）和Tang等人（2004）的總Mb公式僅在Mb 分子量 的數(shù)值上略有不同。

可溶性肉色素總量也可采用Drabkin（1950）的經(jīng)典方法進(jìn)行測(cè)定 。色素提取方法如先前所述（Warriss，1979），使用pH 6.8的0.04 M磷酸鹽緩沖液以MAX限度提取正常pH肉中的色素，或使用pH低于6.8的緩沖液以防止高pH肉產(chǎn)生渾濁的色素提取物（de Duve，1948；Hunt和Hedrick，1977）。 隨后向部分提取液中加入K?[Fe(CN)?]和Potassium Cyanide，將色素轉(zhuǎn)化為氰化高鐵肌紅蛋白形式 。

通過(guò)分光光度法可測(cè)定肌紅蛋白濃度 ，使用氰化高鐵肌紅蛋白在540 nm處的吸收系數(shù) 11.3mM?1 cm?1 及肌紅蛋白分子量17,000（Drabkin，1950）。所有肉類（新鮮、熟食、或腌制）的總血紅素色素含量 可通過(guò)將血紅素組分提取到酸化丙酮中形成血紅素（氯化鐵原卟啉；Hornsey，1956），如第XI-E和XI-F節(jié)所述。

卡爾松和倫德斯特倫（1991）采用溫和試劑（*和Triton X-100）提取血紅素，最終獲得堿性血紅素（鐵原卟啉氫氧化物）。

根據(jù)樣本在575 nm處的吸光度，與堿性血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，測(cè)定肌紅蛋白濃度。

3. 分離肌紅蛋白與血紅蛋白。骨骼肌的粗提物常被用于肌紅蛋白研究，但為減少其他可溶性肌漿蛋白和酶的影響，通常需要使用100%純度的肌紅蛋白。

在第XI-G節(jié)中，福斯特曼和菲利普斯（2001年）詳細(xì)描述了一種通過(guò)硫酸銨沉淀法從肌肉組織中提取血紅素色素的方法，并采用凝膠過(guò)濾層析法將肌紅蛋白與血紅蛋白分離。該方法適用于從多種動(dòng)物物種中純化肌紅蛋白，僅需少量硫酸銨沉淀初始水平的改變。 可通過(guò)測(cè)定純化組分的蛋白質(zhì)含量 ，并考慮初始樣品重量和稀釋因子來(lái)測(cè)定肌紅蛋白和血紅蛋白濃度。

高壓液相色譜法（HPLC）還可用于定量分析總血紅素色素及肌紅蛋白與血紅蛋白的分配情況（奧林格拉特等 人，1990年）。特勞特和古茲克（1996年）提出了一種 HPLC 方法：通過(guò)計(jì)算280納米處的色譜峰面積百分比來(lái)測(cè)定肌紅蛋白占總蛋白的比例，同時(shí)通過(guò)525納米處的色譜峰面積百分比來(lái)確定肌紅蛋白占血紅素蛋白的比例 ，從而實(shí)現(xiàn)肌紅蛋白的分離與純度測(cè)定。

4. 肌紅蛋白形態(tài)的相對(duì)比例 。 肉品表面肌紅蛋白形態(tài)（肌紅蛋白原、肌紅蛋白、肌紅蛋白原結(jié)合態(tài)和肌紅蛋白結(jié)合態(tài)）的相對(duì)比例 會(huì)顯著影響肉品色澤和零售接受度。例如，當(dāng)零售牛肉產(chǎn)品表面肌紅蛋白原結(jié)合態(tài)比例超過(guò)40%時(shí)，消費(fèi)者接受度會(huì)大幅下降（格林等人，1971年）。 肉品表面肌紅蛋白形態(tài)的相對(duì)比例通過(guò)第九節(jié)所述的反射率測(cè)量法 進(jìn)行測(cè)定。 細(xì)胞勻漿液中肌肉樣本的肌紅蛋白形態(tài)比例則通過(guò)其對(duì)應(yīng)峰的吸光度進(jìn)行測(cè)量（特勞特，1989年；唐等人，2004年）。

提取技術(shù)很少能阻止肌紅蛋白的一種形式轉(zhuǎn)化為另一種形式，也無(wú)法提供溶液中氧化還原穩(wěn)定性的可靠信息。Krzywicki（1982）采用特殊的預(yù)防措施和提取條件，以盡量減少MMb的變化；

他在低溫下進(jìn)行萃取，并用緩沖液控制pH值。即便如此，OMb和DMb的比例仍發(fā)生了一些變化。Krzywicki的方程（Krzywicki，1982）被廣泛用于估算 溶液中肌紅蛋白不同氧化還原形式的相對(duì)比例。有時(shí)，這些方程會(huì)為某些氧化還原形式生成負(fù)值 ， 有時(shí)通過(guò)將三種氧化還原形式的總和獲得的估計(jì)值超過(guò)100%。這主要是由于在這些方程中選擇了不合適的波長(zhǎng)（545、565和572nm）。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Tang等人（2004）使用了503 nm的波長(zhǎng)MAX值來(lái)處理MMb，557 nm用于DMb，582 nm用于OMb（圖10.1）。修訂的方程在處理負(fù)值和總和達(dá)到100%方面表現(xiàn)更好（第IX節(jié)）。

5. 溶液中COMb與OMb的鑒別方法。如圖10.2所示，櫻桃紅色氧化還原態(tài) COMb與OMb的吸光度光譜高度相似。傳統(tǒng)肌紅蛋白氧化還原態(tài)估算公式（Krzywicki，1982；Tang等，2004）未考慮COMb的存在。若用這些公式測(cè)定純COMb溶液中棕色色素（MMb）的生成量，會(huì)導(dǎo)致負(fù)值等錯(cuò)誤結(jié)果 ，甚至出現(xiàn)總和超過(guò)100%的情況。為此，研究者采用A503/A581比值作為褐變指數(shù)，該指標(biāo)可間接反映MMb的生成量（Suman等，2006）。通過(guò) 分裂比色皿中COMb 、 OMb 與MMb的組合實(shí)驗(yàn) ，驗(yàn)證了該褐變指數(shù)的有效性。

Nam和Ahn（2002年）研究發(fā)現(xiàn)，有氧包裝火雞胸肉滴液中的OMb（Oxidized Methylbenzene）在541和576納米處呈現(xiàn) β 和 α 特征峰，經(jīng)輻照處理后，這些特征峰分別向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)至536和566納米。研究人員還通過(guò)反射光譜技術(shù)區(qū)分了OMb與COMb。氣相色譜分析證實(shí)輻照樣品中產(chǎn)生了CO。

因此，COMb是輻照火雞胸肌中粉紅色色素的來(lái)源（Nam和 Ahn，2002）。馬OMb的 β 和 α 峰分別位于544和582納米處（Bowen，1949），而COMb的峰則略微向短波長(zhǎng)方向偏移（540或541納米和577納米）（Bowen，1949；S?rheim等人，2006）。雖然理論上可以基于400至700nm的特征光譜區(qū)分COMB和OMb，但目前 無(wú)法確定暴露于一氧化碳和二氧化氧的肉樣中它們的相對(duì)比例 。

6. 線粒體耗氧量。 線粒體活性在死后肌肉耗氧量中起著重要作用，影響肌紅蛋白氧合速率和顏色穩(wěn)定性。隨著肌肉死后年齡的增加，線粒體活性有下降趨勢(shì)。高儲(chǔ)存溫度和高pH值會(huì)顯著影響死后線粒體活性（Cheah和Cheah，1971；Ashmore等人，1972；Bendall和Taylor，1972；Cornforth和Egbert ，1985）。 肉類消耗的氧氣會(huì)影響肌紅蛋白氧合因?yàn)榫€粒體酶和肌紅蛋白之間存在對(duì)可用氧氣的競(jìng)爭(zhēng)。隨著死后線粒體活性的下降，肌紅蛋白氧合速率更高。在肉類中，許多細(xì)胞過(guò)程和細(xì)胞器對(duì)可用氧氣的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)影響肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性和MMb 的減少（Ramanathan等人 ， 2009）。第XI節(jié) - H描述了分離線粒體的方法 ，第XI-I節(jié)描述了測(cè)量線粒體耗氧率的方法。

此外，骨骼肌的線粒體含量因生理來(lái)源不同而存在差異，導(dǎo)致相對(duì)耗氧率（OCR）、 肌紅蛋白氧化還原形態(tài) 在表層與深層的分布，以及肉色穩(wěn)定性等方面存在差異。新鮮肉類在儲(chǔ)存和展示過(guò)程中保持“鮮紅"狀態(tài)的能力也存在差異。

肌肉（阿特金森和福萊特，1973；胡德，1980；奧基夫和胡德，1982；雷內(nèi)爾和拉巴斯，1987；曼奇尼和亨特，2005）研究表明，線粒體含量較高的肌肉通常具有更高的氧化鈣釋放率（OCR），并能形成更多線粒體膜結(jié)合蛋白（MMb）。同樣地，色素流失較快的肌肉往往顏色穩(wěn)定性較差且OCR值較高（奧基夫和胡德 ，1982；雷內(nèi)爾和拉巴斯，1987）。阿特金森和福萊特（1973）還指出，骨骼肌OCR值與色素流失速率呈正相關(guān)——OCR值越高，色素流失速率越快。通過(guò)測(cè)量OCR值，可以評(píng)估不同生理來(lái)源的尸體骨骼肌線粒體活性及其相對(duì)顏色穩(wěn)定性。

肉類科學(xué)家已開(kāi)發(fā)出多種客觀檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定肌肉耗氧量和氧化偶聯(lián)反應(yīng)（OCR），包括瓦爾堡燒瓶法（Urbin和Wilson，1961）、差示呼吸測(cè)定法（DeVore和Solberg，1975）、克拉克氧電極法（Lanari和Cassens，1991；Ramanathan等，2009）、反射光譜法（Madhavi和Carpenter，1993）以及頂空氧分析儀（Sammel等，2002）。光線與肉類色素的相互作用為利用近紅外（NIR ；700-1000納米）技術(shù)檢測(cè)肌紅蛋白（Mb）的氧化還原動(dòng)態(tài)提供了新思路。近期，Mohan團(tuán)隊(duì)（2010a）采用頻域多距離（FDMD）NIR組織血氧儀，實(shí)現(xiàn)了對(duì)骨骼肌中肌紅蛋白氧飽和度和OCR的實(shí)時(shí)、Non-Invasive、直接測(cè)量。

7. 降肌紅蛋白活性（MRA）。測(cè)定MMb所用的方法學(xué)

不同研究者對(duì)肉類活性降低（MRA）的評(píng)估存在顯著差異（參見(jiàn)綜述文章）（Bekhit和Faustman，2005）。測(cè)定 MRA常用的方法是首先誘導(dǎo)MMb的初始水平較高（通常通過(guò)在1%O大氣或亞硝酸鹽誘導(dǎo)氧化包裝），隨后進(jìn)行促進(jìn)MMb還原的檢測(cè)步驟。通過(guò)分析肌肉中總MMb含量在還原步驟中的變化，可評(píng)估肌肉的還原能力。然而，肉類顏色研究者常質(zhì)疑MMb含量變化呈現(xiàn)與解讀的方法是否可靠。

曼奇尼等人（2008年）研究了展示后 MRA 值在表層與深層區(qū)域的差異，并比較了包裝氧濃度對(duì)這些區(qū)域差異及 MRA值的影響。他們還考察了還原甲基甲基溴（MMb）的四個(gè)測(cè)量指標(biāo)——初始MMb形成量（IMF）、還原后MMb量（PRM）、Reduction amount?還原量與相對(duì)還原量 ——與顏色穩(wěn)定性之間的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)MMb/ MRA測(cè)量指標(biāo)與可見(jiàn)表層顏色穩(wěn)定性數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正相關(guān)。研究者指出，不論是表層肌肉 還是 深層還原活性測(cè)量值，均未與表層顏色穩(wěn)定性存在相關(guān)性。

他們發(fā)現(xiàn)，在他們的研究中使用的所有肌肉中，在牛排表面測(cè)量的傳統(tǒng)absolute和相對(duì) MRA 值與表面顏色的相關(guān)性更低 。

福斯特曼和卡森斯（1990年）同時(shí)報(bào)告了absolute有氧還原活性（ARA）和相對(duì)有氧還原活性（MRA）。奧基夫與胡德（1982年）提出，由于不同肌肉組織形成表面肌膜（MMb）的能力存在差異，相對(duì) MRA 在預(yù)測(cè)肌肉顏色方面不如absoluteMRA 準(zhǔn)確。麥肯納等人（2005年）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣本置于1%二氧化氧環(huán)境中時(shí)，部分肌肉組織會(huì)抑制表面肌膜的形成。他們通過(guò)誘導(dǎo)表面肌膜形成抵抗性（RIMF）指標(biāo)，將肌肉還原能力與顏色穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。

薩梅爾等人（2002年）的研究表明，一氧化氮對(duì)MMb的還原能力可用于測(cè)定還原活性。該研究團(tuán)隊(duì)指出，由于其方法最初采用溫和氧化劑（硝酸鈉）， 相較于使用Ferricyanide的檢測(cè)方法，這種方法可能為確定MRA 值提供了更實(shí)用的解決方案。金等人（2011年）沿用薩梅爾團(tuán)隊(duì)（2002年）的方法，監(jiān)測(cè) 牛里脊肉排 在不同個(gè)體間的色澤穩(wěn)定性差異。 研究發(fā)現(xiàn)，初始肉排耗氧速率 、經(jīng)亞硝酸鹽處理后的初始MRA值以及還原后MMb含量，是評(píng)估單個(gè)肉排色澤穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)。

第十一節(jié) - J部分描述了一種測(cè)定完整肌肉切片中MMb還原能力的檢測(cè)方法 ，該方法改編自Watts等人（1966年）的研究。具體操作時(shí)，將樣本置于亞硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使樣本表面的肌肉色素首先被氧化生成MMb。隨后將厚度為1.27厘米的切片真空包裝，在30℃環(huán)境下通過(guò)測(cè)量 K/S 反射率比值（572/525納米波長(zhǎng)）持續(xù)監(jiān)測(cè)表面MMb濃度，持續(xù)2小時(shí)。樣本的還原能力定義為孵育期間表面MMb濃度的百分比下降值。第十一節(jié)-K部分則詳細(xì)說(shuō)明了對(duì)第十一節(jié)-J部分的改進(jìn)方案，用于測(cè)定絞肉樣本的MRA值（Sammel等人，2002年）。

第XI-L節(jié)描述了肌肉勻漿中 MRA 的快速（2分鐘）測(cè)定法（Hagler等人，1979；Madhavi和Carpenter，1993年修改）。

將肌肉濾液+ NADH加入 熒光光度計(jì)比色皿中的MMb+Ferricyanide溶液中，啟動(dòng)反應(yīng)。 在反應(yīng)初始線性階段（1至2分鐘）內(nèi)，通過(guò)OMb在580nm處吸光度的增加監(jiān)測(cè)MMb還元酶活性。

8. 添加底物對(duì) MRA（乳酸、蘋(píng)果酸）的影響。 多位研究人員已對(duì)通過(guò)內(nèi)源性酶系統(tǒng)促進(jìn)MMb還原生成尼古丁酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的潛力產(chǎn)生興趣，包括生化過(guò)程可能有助于維持肉品色澤穩(wěn)定性。沃茨等人（1966）證實(shí)添加NAD可提升肉品的MRA值。當(dāng)使用琥珀酸或細(xì)胞色素c c等底物時(shí)，電子傳遞過(guò)程可將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為NAD。在特定底物條件下，細(xì)胞質(zhì)中的多種脫氫1965能生成NADH。吉丁斯（1974，1977）提出線粒體或亞線粒體顆粒可參與還原肉品中的甲硫胺素（MMb），并推測(cè)線粒體通過(guò)提供關(guān)鍵還原輔因子 還原型 NADH（該物質(zhì)既可由內(nèi)源酶生成，也可通過(guò)逆轉(zhuǎn)電子傳遞過(guò)程產(chǎn)生）來(lái)實(shí)現(xiàn)這一還原作用。

最近，Kim等人（2006）和Mohan等人（2010b）證明了添加從糖酵解（乳酸）或線粒體三羧酸途徑（蘋(píng)果酸）中獲得的底物的效果。兩項(xiàng)研究均報(bào)告了在向 完整肌肉或骨骼肌勻漿 中添加底物后，肉類的 MRA 得到改善。

B. 熟肉研究

肉類色素（肌紅蛋白、血紅蛋白）在烹飪過(guò)程中會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致球蛋白結(jié)構(gòu)解折疊。在有氧條件下，血紅素鐵極易被氧化，暴露的血紅素可能與變性蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，包括肌紅蛋白二聚體或聚集體（Tappel，1957；Ledward，1971）。這些灰褐色復(fù)合物被稱為變性球蛋白半色素，其中“半"表示血紅素鐵處于氧化狀態(tài)。盡管加熱肌紅蛋白（Mb）溶液時(shí)已采用可見(jiàn)光吸收光譜法，但研究熟肉色素時(shí)通常采用反射光譜法（Ledward，1971）。第XI-M節(jié)描述了一種檢測(cè)需氧烹飪?nèi)忸悾?/span>>76°C）中粉紅色變性球蛋白半色素的反射光譜方法。需注意及時(shí)進(jìn)行分析，因?yàn)檫@些色素在空氣中會(huì)迅速褪色（Ghorpade和Cornforth，1992；Cornforth，2001）。

1. 持續(xù)性粉紅現(xiàn)象與過(guò)早褐變——診斷方法。消費(fèi)者有時(shí)會(huì)對(duì)熟肉的粉紅色感到敏感，懷疑產(chǎn)品可能未煮熟。因此，加工廠需要定期檢測(cè)產(chǎn)品以確定 并消除或減少不希望出現(xiàn)的粉紅現(xiàn)象。食材中亞硝酸鹽或硝酸鹽的污染 可能是導(dǎo)致粉紅現(xiàn)象的原因之一（希頓等人，2000年）?？赏ㄟ^(guò)霍恩西（1956年）腌肉色素檢測(cè)法進(jìn)行排查（詳見(jiàn)第XI-E和XI-F節(jié)）。 烤肉表面的粉紅現(xiàn)象也會(huì)因接觸燃燒廢氣中的二氧化氮而呈陽(yáng)性反應(yīng)（科恩福斯 等人，1998年）。燃燒廢氣中可能含有二氧化碳，但霍恩西（1956年）方法僅能檢測(cè)NO-血紅素復(fù)合物，無(wú)法識(shí)別CO-血紅素復(fù)合物。

如果肉確實(shí)未煮熟，未變性的肌紅蛋白含量將高于正常水平。肌紅蛋白在pH>6.0時(shí)對(duì)熱變性具有抵抗力，導(dǎo)致熟肉中的肌紅蛋白濃度高于正常水平，并在內(nèi)部溫度達(dá)到80°C或更高時(shí)呈現(xiàn)紅色或粉紅色（Trout，1989；Moiseev和Cornforth，1999）。在另一個(gè)反向，Hague等人（1994）、Lavelle等人（1995）和Hunt等人。

(1999) 描述了氧化絞肉的過(guò)早褐變， 在烹飪過(guò)程中MMb變性的溫度低于OMb或DMb 。 漢堡肉的過(guò)早褐變有食品安全影響，因?yàn)槿怙灴赡鼙灰暈樵跓o(wú)法殺死食物病原體的烹飪溫度下煮熟完成。

可溶性肌紅蛋白可在磷酸鹽緩沖液中提取，并如第XI - D節(jié)所述，使用分光光度計(jì)在525 nm處測(cè)量吸光度，即肌紅蛋白的等滲點(diǎn)。根據(jù)物種和內(nèi)部烹飪溫度，煮熟的樣品中可能殘留部分可溶性肌紅蛋白。pH值 > 6 . 0的肉類中可溶性肌紅蛋白含量會(huì)高于正常水平。另一方面，過(guò)早褐變的肉類可溶性肌紅蛋白含量低于正常水平，可能與低pH值有關(guān)。確定產(chǎn)品的pH值（第XI - B節(jié)）。

若未變性肌紅蛋白或熟肉色素導(dǎo)致的粉紅色無(wú)法確認(rèn)，則應(yīng)懷疑存在變性血紅素色素。這些粉紅色色素在罐裝或慢燉鍋烹飪等缺氧高溫條件下形成，且需在水下進(jìn)行。具體檢測(cè)方法可參照第XI-M節(jié) 。

c. 熏制肉類研究

本節(jié)闡述了檢測(cè)與定量分析熟肉及腌制肉色素及前體化合物的實(shí)驗(yàn)室方法。腌制肉通常添加亞硝酸鈉或亞硝酸鉀、硝酸鹽進(jìn)行配方處理，烹飪時(shí)會(huì)生成粉紅色的腌制肉色素（單亞硝基血紅素）。天然腌制肉中，腌制劑多為芹菜籽粉或海鹽中的硝酸鹽成分。 在烹飪前 ，通過(guò)微生物發(fā)酵將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為 亞硝酸鹽 。傳統(tǒng)火烤干肉或燒烤肉制品中，一氧化氮?dú)怏w在燃燒時(shí)會(huì)與濕潤(rùn)肉表面的水分反應(yīng)生成亞硝酸根離子，從而引發(fā)烹飪過(guò)程中的表面粉

化（腌制）現(xiàn)象。

1. 腌制肉著色劑。Erdman和Watts（1957）開(kāi)發(fā)了一種有效的方法，通過(guò)監(jiān)測(cè)570/650波長(zhǎng)的表面反射率來(lái)跟蹤腌制肉顏色的變化。該測(cè)量方法可用于指示真空泄漏包裝或其他促進(jìn)顏色褪色的條件 。

經(jīng)固化處理的肉色素經(jīng)基爾德等人鑒定為單硝基血紅素。al.（1988年）通過(guò)質(zhì)譜分析證實(shí)， 硝基化血紅素的質(zhì)量增加了30，這表明結(jié)合了一個(gè)NO基團(tuán)（與先前報(bào)道的兩個(gè)不同，如此）。作為血紅素色素總量的百分比，用以衡量腌制工藝效果的 腌制肉色素含量（霍恩西，1956年）。由于血紅素色素本身是與熱使蛋白質(zhì)變性形成的復(fù)合物，因此無(wú)法直接溶解 。 但 該NO基團(tuán)可通過(guò)80%丙酮（根據(jù)樣品含水量調(diào)整濃度）萃取，并通過(guò)540納米波長(zhǎng)的光譜分析進(jìn)行定量（詳見(jiàn)第XI-E和XI-F節(jié)）。

2. 總血紅素和血紅素鐵含量。 總血紅素含量可通過(guò)以下方法測(cè)定：

將所有含血紅素基團(tuán)的物質(zhì)萃取至80%酸化丙酮中，包括固化與未固化的色素，以及含血紅素的酶類和輔因子（詳見(jiàn)第XI-E和XI-F節(jié)）。

總血紅素含量（以血紅素計(jì)）通過(guò)A 640 法測(cè)定（Hornsey，1956）。固化過(guò)程中將血紅素色素轉(zhuǎn)化為亞硝基血紅素形式的轉(zhuǎn)化率低于80%通常被認(rèn)為是可接受的（Pearson和Tauber，1984）。在Hornsey（1956）方法中，將10g樣品混合在高燒杯中以防止過(guò)度蒸發(fā)。

皮爾遜和陶伯（1984）采用2克樣品和帶蓋試管以防止通過(guò)蒸發(fā)處理，可同時(shí)分析更多樣本。Carpenter和Clark（1995）采用5克樣本。

使用Hornsey（1956）方法進(jìn)行總血紅素測(cè)定可評(píng)估肉類中血紅素鐵含量的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（Carpenter和Clark，1995）。 濕法灰化后肉樣中的總鐵含量可通過(guò)鐵嗪法測(cè)定（Carter，1971），其中 Fe2? 與鐵嗪結(jié)合形成紅色色素，通過(guò)562nm波長(zhǎng)的光譜法檢測(cè)。非血紅素鐵含量可通過(guò)鐵嗪法檢測(cè)HCl-Trichloroacetic acid提取物中的鐵含量（Schricker等，1982）。不銹鋼探針型勻漿器不宜用于鹽酸 - TCA 中的樣品勻漿，因?yàn)殍F會(huì)從探針本身被提取，尤其是較舊、磨損的探針（Jayasingh，2004）。

3. 帕爾馬火腿的紅色素。帕爾馬火腿是意大利帕爾馬地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間腌制豬后腿制成，且不添加硝酸鹽或亞硝酸鹽類腌制鹽。莫里塔等人（1996）采用電子自旋共振光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，帕爾馬火腿的紅色素與亞硝酸鹽腌制肉的色素存在差異。他們進(jìn)一步證實(shí)，從帕爾馬火腿中分離出的葡萄球菌能從MMb（肌紅蛋白）衍生出紅色肌紅蛋白。若松等人（2004）通過(guò)光譜分析、熒光檢測(cè)，并運(yùn)用HPLC 質(zhì)譜和電噴霧電離高分辨質(zhì)譜（ESI - HRMS）對(duì)帕爾馬火腿的鮮紅色素進(jìn)行表征。 研究發(fā)現(xiàn)，這種紅色 色素源自鋅原卟啉IX，而非含鐵血紅素色素。

 一氧化碳可使用非分散紅外分析儀進(jìn)行檢測(cè)。該儀器通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立能量源產(chǎn)生紅外輻射。經(jīng)斬波器調(diào)制的輻射脈沖頻率為5赫茲，通過(guò)光學(xué)濾光片可有效抑制其他紅外吸收物質(zhì)的干擾。每束紅外光束均通過(guò)獨(dú)立檢測(cè)池，其中一個(gè)檢測(cè)池密封設(shè)計(jì)用于盛放標(biāo)準(zhǔn)氣體。

另一單元?jiǎng)t持續(xù)通入樣品氣體（CO），吸收的紅外輻射量與CO濃度成正比 。

D. 包裝尺寸

由于新鮮肉和加工肉的顏色受到與血紅素結(jié)合的配體的深刻影響，而且包裝在商業(yè)上用于最小化新鮮肉和加工肉的顏色變壞，包裝在實(shí)驗(yàn)室分析中需要特別考慮。以下是分析期間包裝樣品的重要考慮因素。

1. 薄膜厚度。能夠以密爾（1/100英寸；參見(jiàn)術(shù)語(yǔ)表）為單位測(cè)量厚度的數(shù)字式測(cè)微計(jì)，可用于測(cè)量薄膜和包裝托盤(pán)的厚度。許多真空包裝袋的厚度為2至3密爾，而用于新鮮零售肉類的氧氣滲透性聚氯乙烯（聚氯乙烯）薄膜覆蓋層通常厚度小于1密爾。一般來(lái)說(shuō)，薄膜厚度越大，氣體滲透性越低。較厚的薄膜也更昂貴。

2. 薄膜滲透性。對(duì)于鮮肉而言，高氧滲透性薄膜可維持氧合血紅素色素（Landrock和Wallace，1955；Cornforth和Allen，2009）。極低氧滲透性薄膜（也稱為高阻隔膜）會(huì)促使脫氧血紅素色素的形成，因?yàn)槿獾倪€原能力（Siegel，2007）。

當(dāng)氧氣分壓較低（1至25毫米汞柱）時(shí)，會(huì)加速氧化反應(yīng)并導(dǎo)致色素褐變（Kropf，2004），這種情況應(yīng)盡量避免。表10.1展示了真空度從零（真空狀態(tài)）到1個(gè)大氣壓（760毫米汞柱）時(shí)，不同真空度下大氣壓與氧氣分壓的變化 。其中特別標(biāo)注了多數(shù)快速褐變的危險(xiǎn)區(qū)域。使用常規(guī)真空包裝機(jī)很難將氧氣含量降至該范圍以下，因此 肉類在消耗包裝內(nèi)殘留氧氣前 往往會(huì) 產(chǎn)生多聚肌肽（MMb）。相比之下，微氣泡包裝技術(shù)能通過(guò) 一次或多次向包裝腔注入目標(biāo)氣體，比真空包裝更有效地降低殘留氧氣水平。無(wú)論采用何種包裝系統(tǒng)，都需謹(jǐn)慎控制以確保氧氣分壓足夠低。

氧氣，以確保肉質(zhì)消耗殘留氧氣的能力不會(huì)被超出。

無(wú)論包裝內(nèi)真空度如何，殘留氣體的成分比例始終與空氣基本一致：氮?dú)?/span>78.1%、氧氣20.9%、氬氣0.9%、二氧化碳0.03%。不過(guò)，像氧氣電極這樣的傳感器檢測(cè)到的氣體濃度，其實(shí)與產(chǎn)品周圍的大氣壓成正比。舉個(gè)例子，當(dāng)真空度達(dá)到大氣壓一半時(shí)，可測(cè)得的氧氣濃度為10.45%（104,500ppm），此時(shí)氧氣分壓為79.6毫米汞柱（380/760×159.2毫米汞柱；見(jiàn)表10.1）。包裝膜的透氣性對(duì)抑制氧氣滲入同樣關(guān)鍵，尤其是出口產(chǎn)品這類保質(zhì)期較長(zhǎng)的商品，更需要嚴(yán)防死守。

包裝薄膜、袋子、和托盤(pán)的氣體滲透性通常包括 水蒸氣和氧氣的滲透率。二氧化碳、一氧化碳和氮?dú)獾臐B透率數(shù)據(jù)較少。

滲透率不僅隨薄膜厚度變化，還受其他因素影響。研究報(bào)告應(yīng)包含薄膜滲透率的相關(guān)信息。

3. 改良大氣包裝技術(shù)。 高氧阻隔包裝膜可 結(jié)合多種頂空氣體，有效調(diào)控并保存肉類中的色素形態(tài)。二氧化碳因其抗菌特性在改良大氣包裝中應(yīng)用廣泛。但氮?dú)馀c二氧化碳對(duì)色素形態(tài)基本無(wú)影響，因此它們存在于改良大氣包裝頂空時(shí)不會(huì)改變?nèi)馄飞珴桑?/span>Moeller等，2004）。高氧環(huán)境有助于維持氧合血紅素色素形態(tài)（Georgala和Davidson，1970；O‘Sullivan和Kerry，2010），但需注意肉品的呼吸能力，避免氧氣消耗過(guò)量導(dǎo)致甲基甲藍(lán)（MMb）生成（Bekhit和Faustman，2005）。若包裝頂空存在一氧化碳或一氧化氮?dú)怏w，或使用含亞硝酸鈉晶體的包裝膜，會(huì)形成反映這些化合物結(jié)合的色素形態(tài)（Siegel，2007,2009）。

4. 包裝氣體成分檢測(cè)。 為驗(yàn)證MAP系統(tǒng)能否達(dá)到目標(biāo)氣體成分并確保儲(chǔ)存期間成分穩(wěn)

定，需對(duì)包裝內(nèi)氣體成分進(jìn)行檢測(cè)報(bào)告。由于肉類呼吸作用和氣體吸收 ，MAP系統(tǒng)中的相對(duì)氣體成分在包裝保質(zhì)期內(nèi)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化；因此，需要精準(zhǔn)確定采樣時(shí)間。通過(guò)自密封隔膜用注射器抽取包裝樣本，可借助頂空氣體分析儀測(cè)定氧氣、一氧化碳和二氧化碳濃度（Knock等人，2005；Mancini等人，2009 ；Raines和Hunt，2010）。

e. 脂質(zhì)氧化對(duì)肉品色澤（新鮮、熟成、腌制）的影響

多數(shù)肉類色澤研究都會(huì)檢測(cè)脂質(zhì)氧化指標(biāo) ， 因?yàn)榧〖t蛋白氧化通常與脂質(zhì)氧化密切相關(guān) 。 脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)會(huì)引發(fā)肌紅蛋白構(gòu)象變化 ， 導(dǎo)致血紅素氧化加劇并產(chǎn)生褐變（Alderton等，2003）。魚(yú)類血紅蛋白在儲(chǔ)存過(guò)程中釋放的血紅素同樣會(huì)刺激脂質(zhì)氧化（Grunwald和Richards，2006）。類似地，加熱過(guò)程中從血紅素中釋放的離子態(tài)鐵也可能刺激脂質(zhì)氧化 ， 這可通過(guò)硫代Barbituric acid反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)量（Igene等，1985）。

脂質(zhì)氧化程度可通過(guò)多種技術(shù)手段測(cè)定，包括揮發(fā)性氧化產(chǎn)物頂空分析（Watanabe等，2008）和感官評(píng)價(jià)，但在肉類制品中常用的是 TBARS 檢測(cè)法。TBARS檢測(cè)法基于硫代Barbituric acid與脂質(zhì)氧化醛產(chǎn)物（尤其是2,4-亞烷基二醛）反應(yīng)生成粉紅色顯色劑的原理，該顯色劑在530-535納米波長(zhǎng)處具有MAX吸光度（Marcuse和Johansson，1973）。丙二醛（MDA）是用于 TBARS 標(biāo)準(zhǔn)曲線的化合物。該檢測(cè)法可對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行快速檢測(cè)，1天內(nèi)即可得出結(jié)果，且 TBARS 值與感官測(cè)試結(jié)果高度相關(guān)。

當(dāng) TBARS 值>1.0時(shí)，通常表明煮熟的肉樣存在可檢測(cè)的氧化性氣味和風(fēng)味（Greene和Cumuze，1981）。Tarladgis等人（1960）開(kāi)發(fā)了廣泛使用的蒸餾法（第十一節(jié) - P）， 具體操作是將 硫代Barbituric acid（TBA）溶液加入樣品冷凝液中。為簡(jiǎn)化蒸餾步驟，可直接將TBA溶液加入肉樣中，對(duì)未加熱樣本需等待數(shù)小時(shí) 使顯色劑形成（Witte等人，1970），或如第XI-O節(jié)所述，通過(guò)10分鐘煮沸處理（Buege和Aust，1978）。

在 TBARS 檢測(cè)中，當(dāng)存在大量脂類衍生醛類（Marcuse和Johansson，1973）及糖類（包括蔗糖，Du和Bramlage，1992）時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生MAX吸光度為453 nm的黃色顯色劑。為消除糖類引發(fā)的黃色干擾，Du和Bramlage（1992）開(kāi)發(fā)了改良方法，采用MDA和蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。另一種解決方案是采用Tarladgis等人（1960）的原始蒸餾法處理含葡萄干（含糖量70%）的肉樣，由于糖醛類化合物不揮發(fā)，不會(huì)被樣品冷凝液捕獲，從而避免了黃色顯色現(xiàn)象（Vasavada和Cornforth，2006）。

在腌制肉制品中， TBARS 值會(huì)受到殘留亞硝酸鹽的影響。為此，Zipser和Watts（1962年）改進(jìn)的 TBARS 測(cè)定法會(huì)在 蒸餾前向腌肉樣品中添加磺胺類化合物，以防止殘留亞硝酸鹽引發(fā)丙二醛亞硝化反應(yīng)導(dǎo)致的誤判 。但值得注意的是，磺胺類化合物的添加本身也會(huì)改變 TBARS 值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)亞硝酸鹽濃度為100-200ppm時(shí)，添加磺胺類化合物的腌肉 TBARS 值始終高于未添加組。然而在0-50ppm的低濃度亞硝酸鈉條件下，磺胺類化合物的存在反而會(huì)使 TBARS 值持續(xù)降低（Shahidi等，1985年）。

F. 基礎(chǔ)研究方法

1. 肌紅蛋白的質(zhì)譜表征技術(shù)。肉品色澤穩(wěn)定性受多種內(nèi)在與外在因素影響，包括物種特異性差異、紅白肌纖維分布特征及肌紅蛋白化學(xué)特性。 質(zhì)譜分析作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的關(guān)鍵工具，在肉類科學(xué)領(lǐng)域已展現(xiàn)出在肌紅蛋白功能特性研究中的巨大應(yīng)用潛力。為探究肉品色澤的物種特異性差異，Joseph等人（2010a）采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)展研究。

采用質(zhì)譜法對(duì)野牛肌紅蛋白進(jìn)行表征；約瑟夫等人（2010a）對(duì)火雞肌紅蛋白進(jìn)行表征；蘇曼等人（2010）對(duì)鴯鹋肌紅蛋白進(jìn)行表征。

蛋白質(zhì)和肽是肌肉食品的主要成分，對(duì)烹飪過(guò)程中食品蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化至關(guān)重要。食品蛋白質(zhì)組學(xué)已開(kāi)始影響食品鏈的諸多環(huán)節(jié)，包括食品生產(chǎn)、食品安全和質(zhì)量控制。近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用變換了蛋白質(zhì)特征分析、氨基酸測(cè)序以及細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜的研究。 蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展為肉類科學(xué)家提供了新機(jī)遇，使他們能夠深入探究食材相互作用的分子機(jī)制，從而優(yōu)化肉類色澤及其穩(wěn)定性研究。

曼奇尼團(tuán)隊(duì)（2010年）運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，揭示了乳酸影響牛肉色澤穩(wěn)定性的作用機(jī)制。通過(guò)質(zhì)譜分析，科研人員能夠系統(tǒng)研究原料間的相互作用、加工過(guò)程引發(fā)的改變，并精準(zhǔn)定位食品鏈中最易出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題、微生物污染和營(yíng)養(yǎng)流失的環(huán)節(jié)。盡管食品蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類科學(xué)領(lǐng)域尚屬新興領(lǐng)域，但這項(xiàng)技術(shù)已為改善人類健康作出重要貢獻(xiàn) 。

2. 氧代謝檢測(cè)技術(shù)用于測(cè)定包裝肉中肌紅蛋白形態(tài)的相對(duì)濃度。 肉類色澤的生化因素研究已持續(xù)數(shù)十年，但鮮有研究聚焦于開(kāi)發(fā)非侵入性方法 / 技術(shù)，以快速實(shí)時(shí)評(píng)估肉類整體品質(zhì)。盡管該領(lǐng)域已取得顯著進(jìn)展，現(xiàn)有表征肉色參數(shù)和預(yù)測(cè)肉色穩(wěn)定性的技術(shù) 仍存在局限性——這些方法具有侵入性、耗時(shí)費(fèi)力且僅能間接反映肌紅蛋白的氧化還原狀態(tài)。類似地，用于表征組織結(jié)構(gòu)的檢測(cè)技術(shù)（如耗氧量和線粒體活性相關(guān)技術(shù)）也存在相同缺陷。肉類中光與肌肉色素的相互作用為開(kāi)發(fā)近紅外（NIR）檢測(cè)肌紅蛋白氧化還原動(dòng)態(tài)的方法提供了新思路。

700至1000納米技術(shù)。

近紅外光譜（NIRS）已被廣泛用于 醫(yī)學(xué)診斷和運(yùn)動(dòng)生理學(xué)中確定肌紅蛋白和血紅蛋白的氧吸收（Ferreira等人，2005）。 NIRS 是一種Non-Invasive、連續(xù)和快速（25至35absolute濃度的方法（Mohan等人，2010a）。

基于 NIRS 光-組織相互作用的基本方法 能實(shí)時(shí)提供關(guān)于肉類光學(xué)特性和吸收模式的寶貴信息，同時(shí)定量分析肉表面及次表層的肌紅蛋白氧化還原形態(tài)。由于 NIR 光能深入穿透如肉類等生物組織，NIRS 技術(shù)有望成為非侵入性大視場(chǎng)成像 死后肌肉研究的有效手段。 由于肌紅蛋白與血紅蛋白在 NIR 波段吸收波長(zhǎng)相同， 同一方法也可用于測(cè)定 肉類肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性及其他結(jié)構(gòu)特征，這將最終幫助我們理解后處理工藝對(duì)肌紅蛋白化學(xué)性質(zhì)的影響。