本文要點：含吡啉結(jié)構(gòu)域蛋白3（NLRP3）炎癥小體的靶向NOD樣受體家族小干擾RNA（siRNA）已成為減少缺血性腦卒中后梗死體積和減輕腦損傷的重要治療策略。然而，基于siRNA的療法在臨床轉(zhuǎn)化中面臨血腦屏障（BBB）的重大阻礙，限制了藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲透。為突破這一瓶頸，本文開發(fā)了創(chuàng)新型長循環(huán)近紅外二區(qū)（NIR-II）納米顆粒平臺YWFC NPs，通過精密設計增強BBB轉(zhuǎn)胞吞作用，實現(xiàn)siNLRP3的高效遞送（siNLRP3@YWFC NPs），并在缺血性腦卒中臨床前模型中驗證其有效性。進一步地，研究者整合先進深度學習神經(jīng)網(wǎng)絡算法優(yōu)化腦梗死半暗帶的體內(nèi)NIR-II成像，在卒中后72小時獲得顯著提升的信背比（SBR）?；诖竽X中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型的在體研究表明，通過延長NIR-II成像引導的siNLRP3@YWFC NPs圖像導向治療可產(chǎn)生顯著療效優(yōu)勢。

動物活體成像系統(tǒng)

圖1. 深度學習增強NIR-II成像和圖像引導siRNA (siNLRP3@YWFCNPs）治療缺血性卒中示意圖

本研究開發(fā)了靶向NLRP3炎癥小體的siNLRP3@YWFC納米顆粒，其搭載全氟化碳及血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）主動靶向側(cè)鏈的超長循環(huán)近紅外二區(qū)平臺（YW-F13/YW-CC=9:1 重量比），可穿透血腦屏障并精準遞送治療至大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型的腦梗死區(qū)域。該納米顆粒在體外和體內(nèi)實驗中均顯示出抑制中樞炎癥、減輕腦組織損傷及改善神經(jīng)功能的作用。研究通過深度學習增強的NIR-II平臺，在治療過程中同步實現(xiàn)腦梗死周圍半暗帶定位與梗死周邊炎癥浸潤程度的精準成像、輪廓勾畫及定量分析。

圖2. YW、YW-F13和YW-CC的合成、光學和物理性能

本文開發(fā)了一種新的長循環(huán)近紅外二區(qū)（NIR-II）納米平臺，由全氟碳YW-F13和VCAM-1主動靶向側(cè)鏈的混合物組成（F13 = HO(CH2)2(CF2)5CF3；CC = CVHSPNKKC(Acm)）。這種組合旨在促進BBB的穿越（圖2a）。圖2b顯示，YW的HOMO-LUMO帶隙約為1.75 eV，與NIR-II噻吩并噻唑染料的閾值（通常約為1.6 eV）非常接近。納米平臺高度扭曲的主鏈，間隔基和電子供體之間的扭轉(zhuǎn)角分別為31.04°和34.53°（圖2c），使得π共軛主鏈可以通過側(cè)鏈延伸。這種結(jié)構(gòu)特性是減少分子間相互作用的關(guān)鍵，可能增強納米載體在生物系統(tǒng)中的穩(wěn)定性和功效。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡實驗進一步證明（圖2d-2e），用促炎細胞因子TNF-α處理細胞6小時后，VCAM-1表達量增加了1.5倍以上（圖2f）。

圖3. 體外攝取和溶酶體逃逸能力siCtrl@YW-F13/YW-CC NPs

優(yōu)化YW-F13和YW-CC在包載材料中的重量比對于提高納米平臺靶向和遞送至BALB/c小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（bEnd.3）的效率至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，以YW-F13與YW-CC的9:1比例包載Cy5-siCtrl的Cy5-siCtrl@YWFC納米粒子在bEnd.3細胞中展現(xiàn)出最高的細胞攝取效率，如共聚焦熒光顯微鏡和細胞流式攝取實驗所示（圖3a-c）。合成并確認了能有效與siRNA形成復合物的類脂質(zhì)材料G0-C14，其重量比為10。如圖3d所示，Cy5-siCtrl@YWFC納米粒子（紅色）的內(nèi)化主要與晚期內(nèi)體（綠色）共定位，孵育4小時后表明初始的內(nèi)吞作用和向晚期內(nèi)體的運輸。然而，12小時后，大多數(shù)納米粒子不再與內(nèi)體共定位，表明成功逃逸內(nèi)體并釋放到細胞質(zhì)中。

YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子均形成均勻分散的球形膠束，透射電子顯微鏡（TEM）測定的平均直徑分別約為150納米（圖3e）和180納米（圖3f）。YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子的zeta電位（圖3g）分別為約-2.17毫伏和約-0.98毫伏。YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子的光致發(fā)光激發(fā)映射（圖3h-i）顯示最大吸收峰分別在約738納米和740納米處，最大發(fā)射峰分別在約1038納米和1048納米處。與ICG相比，YWFC納米粒子和siCtrl@YWFC納米粒子均展現(xiàn)出更好的光穩(wěn)定性，在持續(xù)激發(fā)60分鐘的磷酸鹽緩沖液（PBS）中幾乎無衰減（圖3j）。重要的是，在含10%血清的PBS中孵育7天后未觀察到顯著降解，表明這些納米粒子具有相當大的穩(wěn)定性。

圖4. 缺血性卒中活體NIR-II成像的深度學習

在小鼠短暫大腦中動脈閉塞（tMCAO）后4小時，分別給予YWFC納米粒子和YWF納米粒子（5毫克/毫升，200微升）。通過NIR-II熒光成像從注射后10分鐘至72小時動態(tài)可視化缺血性中風（IS）梗死區(qū)域（圖4a）。利用基于深度學習的無監(jiān)督轉(zhuǎn)換將NIR-II圖像轉(zhuǎn)換為高分辨率圖像（圖4b）。通過基于知識蒸餾的無監(jiān)督學習方案，使用不成對的高分辨率（HR）和低分辨率（LR）圖像訓練循環(huán)生成對抗網(wǎng)絡，并用于處理NIR-II圖像（圖4c）。在生成器之間進行不同域之間的轉(zhuǎn)換后，判別器DL和DH用于區(qū)分生成的圖像和真實圖像。用于圖像翻譯和分割的學生網(wǎng)絡采用U-Net結(jié)構(gòu)，在有限的訓練數(shù)據(jù)下提供高性能。對于低分辨率圖像輸入，SGLH/SGHL和TGLH/TGHL模型均生成圖像，教師模型和學生模型之間的差異用于指導學生的學習過程。如圖4d所示，NIR-II圖像首先轉(zhuǎn)換為四通道圖像，然后輸入蒸餾模型進行分割。SSeg和TSeg模型同時分割同一圖像，差異指導學生的學習。

基于深度學習的方法通過將次優(yōu)的低分辨率圖像轉(zhuǎn)換為清晰的高分辨率圖像來增強NIR-II成像，如NIR-IIb成像所示。此外，深度學習方法能夠生成定量指標，用于通過血管分割對血管密度進行比較分析。如圖4e所示，在MCAO小鼠中，靜脈注射YWF納米粒子和YWFC納米粒子后10分鐘，梗死區(qū)域的熒光信號明顯低于對側(cè)非梗死區(qū)域，從而能夠在分鐘級別識別缺血性中風（圖4f）。深度學習模型被用于分析梗死和對側(cè)非梗死腦區(qū)域的血管結(jié)構(gòu)，能夠有效區(qū)分炎癥浸潤，具有高度統(tǒng)計學顯著性（P < 0.0001，圖4f）。相比之下，未注射NIR-II納米材料的PBS組在成像儀下未顯示任何圖像。此外，在MCAO小鼠中，靜脈注射YWFC納米粒子后，病變部位（半暗帶區(qū)域）的NIR-II熒光信號從6小時到72小時逐漸增加，并在72小時達到峰值。在72小時，重建的NIR-IIb熒光成像的信背比（SBR）為6.00，比原始NIR-II熒光成像的SBR 3.30增加了1.85倍，或改善了85.1%。相比之下，由于缺乏靶向肽，YWF納米粒子在病變部位的富集較少（圖4g）。有趣的是，在梗死半暗帶區(qū)域，NIR-II熒光富集的顯著差異持續(xù)了長達3天，這可能是由于YWFC納米粒子在病變部位的長時間循環(huán)（圖4h）。

圖5. siNLRP3@YWFC NPs壓制NLRP3并抑制了體外下游相關(guān)炎癥蛋白的表達

siNLRP3–1770在RT-qPCR和Western blotting實驗中顯示出最高的干擾NLRP3表達的效率，作為為后續(xù)研究的對象。在75 nM濃度下，經(jīng)過72小時后，siNLRP3@YWFC納米粒子對NLRP3的敲低效率在RNA和蛋白質(zhì)水平上均超過60%，而未處理的細胞作為對照組（圖5a-5c）。

此外，開發(fā)了一種氧糖剝奪/再氧合（OGD/R）模型來模擬體外的缺血再灌注。該模型用于評估siNLRP3@YWFC納米粒子對腦缺血再灌注損傷（CIRI）的神經(jīng)保護作用（圖5d-5f）。將OGD/R處理的BV2細胞作為4小時的陽性對照，并收集細胞蛋白進行Western blot分析。靶向處理組siCtrl@YWFC納米粒子作為對照，而非靶向處理組siNLRP3@YWF納米粒子和靶向處理組siNLRP3@YWFC納米粒子作為處理組。如圖5g-5h所示，OGD/R陽性對照顯著上調(diào)了NLRP3炎性體的表達。非靶向siNLRP3@YWF納米粒子和靶向siNLRP3@YWFC納米粒子分別有效敲低了NLRP3表達71.7±7.6%和83±3.2%，并抑制了下游蛋白IL-18（45.2±4.2%, 50.7±6.1%）、IL-1β（43.4±10.7%, 54.4±9%）、裂解的caspase-1（32±8.8%, 40.8±8.7%）和ASC（42.3±15.7%, 54.2±9.4%）的表達。靶向處理組對NLRP3炎性蛋白的抑制最為顯著，強烈表明siNLRP3@YWFC納米粒子通過敲低NLRP3炎性體減輕了炎癥反應。

參考文獻

Yu K, Fu L, Chao Y, et al. Deep Learning Enhanced Near Infrared-II Imaging and Image-Guided Small Interfering Ribonucleic Acid Therapy of Ischemic Stroke[J]. ACS nano, 2025，19, 10, 10323–10336.

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動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

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