本文要點(diǎn)：腦側(cè)支循環(huán)與血腦屏障（BBB）對(duì)維持正常腦功能至關(guān)重要，受限于現(xiàn)有方法對(duì)腦血流微小通路的記錄能力，學(xué)界對(duì)生理和病理狀態(tài)下側(cè)支灌注與血腦屏障動(dòng)態(tài)演變的認(rèn)知仍顯不足。本文報(bào)道了一種由小分子染料與牛血清白蛋白構(gòu)成的高結(jié)晶度半導(dǎo)體有機(jī)納米探針（命名為4T-BSA），其在第二近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）展現(xiàn)出顯著的活體腦血管成像潛力。該探針在完整小鼠腦中具有成像穿透深度，信背比（SBR）達(dá)6.0，并能在三種典型shen經(jīng)的病理生理模型中實(shí)現(xiàn)低至50微米級(jí)的腦血管空間分辨率。通過(guò)可視化血管側(cè)支灌注與白蛋白滲漏，4T-BSA納米探針精準(zhǔn)識(shí)別了與動(dòng)/靜脈側(cè)支血流網(wǎng)絡(luò)及血腦屏障破壞相關(guān)的腦病理活動(dòng)。本項(xiàng)研究，基于NIR-II成像的腦側(cè)支循環(huán)與血腦屏障損傷評(píng)估技術(shù)，將為神經(jīng)系統(tǒng)疾病及時(shí)干預(yù)、神經(jīng)保護(hù)及功能修復(fù)等重大醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)提供廣闊解決方案。

全光譜小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)

本研究開(kāi)發(fā)了一種高結(jié)晶度半導(dǎo)體有機(jī)NIR-II納米探針（命名為4T-BSA）。該探針通過(guò)修飾CH1055分子的功能基團(tuán)后，與牛血清白蛋白（BSA）非共價(jià)組裝形成新型分子復(fù)合物。研究團(tuán)隊(duì)在1350 nm窄波段（NIR-IIa區(qū)）開(kāi)展了系統(tǒng)的體外與活體成像實(shí)驗(yàn)，并與傳統(tǒng)光學(xué)及磁共振成像技術(shù)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)對(duì)象涵蓋腦動(dòng)脈閉塞（MCAO）、腦靜脈竇血栓（CVST）及戊四氮點(diǎn)燃癲癇等典型shen經(jīng)的病理生理模型。多維度證據(jù)表明，4T-BSA納米探針能夠高保真記錄生理狀態(tài)下深部腦血管血流動(dòng)力學(xué)特征及動(dòng)靜脈側(cè)支循環(huán)響應(yīng)（圖1a–c）。尤為重要的是，得益于對(duì)血清白蛋白的高親和力，該探針可在病理?xiàng)l件下（特別是血腦屏障早期滲漏階段）實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)、實(shí)時(shí)的血腦屏障微滲漏動(dòng)態(tài)追蹤（圖1d,e）。

圖2. 4T-BSA納米探針的結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性

將CH1055的四個(gè)羧酸基團(tuán)全部替換為更具負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)（命名為4T），然后與牛血清白蛋白（BSA）組裝形成4T-BSA納米探針（圖2a）。4T和4T-BSA納米探針的紫外-可見(jiàn)（UV–vis）光譜在320-1000 nm范圍內(nèi)顯示出相似的吸收信號(hào)。如圖2b所示4T和BSA的自組裝在近紅外二區(qū)（NIR-II）成像系統(tǒng)下導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著增加（圖2b插圖）。4T-BSA納米探針在≈990 nm處有最大熒光發(fā)射峰，在808 nm激發(fā)下，其發(fā)射強(qiáng)度比4T高出110倍以上。在808 nm激發(fā)下，4T-BSA在990 nm處的量子產(chǎn)率計(jì)算為5.3%。透射電子顯微鏡（TEM）圖像及其對(duì)應(yīng)的粒徑分布直方圖（圖2c）清楚地表明，4T-BSA納米探針具有膠體穩(wěn)定性，呈球形，平均直徑為5.5±0.6 nm。通過(guò)高分辨率透射電子顯微鏡（HR-TEM）仔細(xì)測(cè)量，在4T-BSA納米探針中可以直接觀察到發(fā)育良好的晶格邊緣，其晶面間距約為0.25 nm（圖2d）。元素分布的映射表明存在富含硫的黃色區(qū)域，表明小分子4T自組裝到BSA的內(nèi)部。原子力顯微鏡（AFM）證實(shí)，4T-BSA納米探針在水中表現(xiàn)出優(yōu)異的單分散性，主要直徑位于3-7 nm范圍內(nèi)（圖2f），與TEM分析一致。通過(guò)選擇從1150到1400 nm的連續(xù)長(zhǎng)通濾波器，發(fā)現(xiàn)腦血管在長(zhǎng)達(dá)1350 nm的更長(zhǎng)波長(zhǎng)窗口處比在較短波長(zhǎng)窗口處更清晰，之后深層血管的信號(hào)開(kāi)始減弱（圖2g）。對(duì)腦血管橫截面強(qiáng)度輪廓的進(jìn)一步量化信噪比（SBR）測(cè)量表明，在808 nm激發(fā)下，NIR-II成像的最大分辨率在1350 nm長(zhǎng)通濾波器（NIR-IIa窗口）（圖2h）。在之后的部分中，除非另有說(shuō)明，否則成像在NIR-IIa窗口中進(jìn)行。

圖3. 利用4T-BSA納米探針在不同小鼠模型中對(duì)腦血管進(jìn)行高分辨率NIR-IIa熒光活體成像

為了探究近紅外二區(qū)（NIR-II）成像觀察腦循環(huán)系統(tǒng)病理生理過(guò)程的可行性，分別將4T-BSA和吲哚青綠（ICG）-BSA納米探針以等效劑量（35 nM）通過(guò)靜脈注射到三種典型的shen經(jīng)的病理生理學(xué)小鼠模型中（每組3只）。在808 nm激光照射下，通過(guò)完整的頭皮和頭骨，在狹窄的1350-1650 nm成像區(qū)域內(nèi)，對(duì)小鼠腦的腦血管系統(tǒng)進(jìn)行了大視場(chǎng)成像記錄。與ICG-BSA納米探針在NIR-I（<900 nm）區(qū)域中無(wú)法區(qū)分的血管和較低的信噪比（SBR）。形成鮮明對(duì)比的是，4T-BSA納米探針在NIR-IIa窗口中的腦血管熒光成像明顯顯示出更高的空間分辨率，無(wú)論是在哪種shen經(jīng)的病理生理學(xué)小鼠模型中。在假NIR-IIa組（圖3a、d）中，通過(guò)4T-BSA納米探針拍攝的腦血管造影清晰地顯示了大腦中動(dòng)脈（MCA）、下腦靜脈、上矢狀竇（SSS）、橫竇、竇匯，以及頭皮和頭骨下的雙側(cè)大腦半球中的大量皮質(zhì)血管和腦微血管。4T-BSA納米探針在NIR-IIa區(qū)域中SSS的信噪比（圖3d）計(jì)算為6.0±0.1，這明顯高于ICG-BSA在NIR-I窗口中的信噪比（1.7±0.2；P<0.01）。在NIR-IIa區(qū)域中成像的SSS的高斯擬合半高全寬（FWHM）估計(jì)為702±3.9 µm（圖3g），而通過(guò)ICG-BSA納米探針成像的SSS的FWHM增加到1105±8.2 µm。此外，左右大腦中動(dòng)脈區(qū)域選定血管的FWHM分別為206±2.3和149±4.1 µm。

在大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）的NIR-IIa組中，4T-BSA納米探針的NIR-II熒光信號(hào)在對(duì)側(cè)大腦半球的右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）區(qū)域可以明顯觀察到（圖3b、e），而在左側(cè)（同側(cè)）半球幾乎沒(méi)有信號(hào)（用白色虛線圈標(biāo)出）。右側(cè)MCA區(qū)域選定血管的橫截面強(qiáng)度輪廓的半高全寬（FWHM）被確定為197±7.1 µm，而在左側(cè)的鏡像動(dòng)脈上無(wú)法實(shí)現(xiàn)這一測(cè)量（圖3h），這表明MCA區(qū)域存在低灌注。同樣，在腦靜脈竇血栓形成（CVST）的NIR-IIa組中，4T-BSA納米探針可以照亮雙側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)域（圖3f）。左側(cè)MCA區(qū)域選定血管的FWHM為129±5.2 µm，信噪比（SBR）高達(dá)5.2±0.1（圖3i），而在上矢狀竇（SSS）區(qū)域幾乎沒(méi)有監(jiān)測(cè)到熒光信號(hào)。因此，NIR-IIa成像能夠準(zhǔn)確定位CVST模型中的血栓位置。

圖4. 4T-BSA納米探針NIR-IIa活體成像定量分析不同shen經(jīng)的病理生理模型小鼠血流動(dòng)力學(xué)腦灌注

為了研究局部腦血流，研究人員分別通過(guò)尾靜脈注射將35 nM的4T-BSA納米探針注入假手術(shù)（sham）、大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）和腦靜脈竇血栓形成（CVST）模型的C57BL/6小鼠體內(nèi)。通過(guò)時(shí)間序列的NIR-IIa成像（1350 nm長(zhǎng)通濾波器、808 nm激發(fā)，成像速率為每秒1幀）記錄信號(hào)波動(dòng)，以研究無(wú)需開(kāi)顱情況下腦部視野內(nèi)的信號(hào)變化。在假手術(shù)NIR-IIa組中，NIR-II熒光強(qiáng)度隨注射后時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加。如預(yù)期所示，左側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）區(qū)域的NIR-IIa信號(hào)強(qiáng)度幾乎與相應(yīng)的右側(cè)區(qū)域相等，表明雙側(cè)MCA區(qū)域的灌注率相同。在MCAO組中，4T-BSA納米探針的熒光信號(hào)（圖4b中綠色虛線圈標(biāo)出）在注射后1秒內(nèi)立即出現(xiàn)在右側(cè)MCA（對(duì)側(cè)）區(qū)域。值得注意的是，右側(cè)MCA的熒光信號(hào)迅速增加，并在注射后約40秒達(dá)到平穩(wěn)，而左側(cè)MCA（同側(cè)）區(qū)域幾乎沒(méi)有NIR-IIa信號(hào)出現(xiàn)（圖4b中黃色虛線圈標(biāo)出）。動(dòng)態(tài)熒光信號(hào)波動(dòng)分析表明，大腦左側(cè)MCA區(qū)域的血流灌注顯著減少。例如，右側(cè)MCA區(qū)域的腦血流灌注率比相應(yīng)的左側(cè)缺血MCA區(qū)域高出約五倍。此外，在假手術(shù)組中，矢狀竇（SSS）的前后區(qū)域的NIR-IIa信號(hào)沒(méi)有明顯差異。令人印象深刻的是，在CVST組中，4T-BSA納米探針注射后，SSS前區(qū)域（圖4c中黃色虛線圈）的NIR-IIa熒光信號(hào)可以立即觀察到。同時(shí)，SSS后區(qū)域（圖4c中綠色虛線圈）的NIR-IIa信號(hào)幾乎可以忽略不計(jì)，這代表了血栓形成的部位。如圖4g總結(jié)所示，SSS前區(qū)域的腦血流灌注率比后區(qū)域高出約四倍，表明由于SSS后區(qū)域的竇血栓（阻塞）導(dǎo)致靜脈回流障礙。

圖5. 在體實(shí)時(shí)記錄腦內(nèi)動(dòng)脈或靜脈側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò)的演變

研究人員探討了4T-BSA納米探針在大型顱內(nèi)血管（大腦中動(dòng)脈或矢狀竇）近端阻塞時(shí)，準(zhǔn)確測(cè)量腦部微血管動(dòng)靜脈側(cè)支循環(huán)的潛力。將整個(gè)小鼠頭部放置在激光下的成像平臺(tái)上，然后在通過(guò)尾靜脈向MCAO和CVST模型的C57BL/6小鼠體內(nèi)注射35 nM的4T-BSA納米探針后，連續(xù)記錄90分鐘。

在MCAO組中，在低倍率（2.5×）下實(shí)時(shí)捕捉整個(gè)小鼠頭部的動(dòng)態(tài)圖像，可用于觀察整個(gè)小鼠頭部（圖5a）。值得注意的是，NIR-IIa動(dòng)態(tài)圖像（40分鐘）中的藍(lán)色箭頭代表一種血管畸形，這由4T-BSA納米探針在腦血管中的明亮發(fā)射強(qiáng)度證實(shí)。在放大左側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)域后，通過(guò)NIR-IIa動(dòng)態(tài)成像的高倍率（10×）監(jiān)測(cè)感興趣區(qū)域（圖5a中的藍(lán)色虛線矩形），以明確血流低灌注的細(xì)節(jié)。如圖所示，在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘，明確觀察到單一毛細(xì)血管的血流灌注（圖5b中的白色箭頭）。圖5b中藍(lán)色虛線穿過(guò)血流灌注區(qū)域的橫截面強(qiáng)度輪廓證實(shí)了在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘新生血管的出現(xiàn)（圖5d）。這些新生血管的特征是尖銳的峰值，半高全寬（FWHM）約為42微米。NIR-IIa血流灌注成像表明皮質(zhì)動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的開(kāi)通，這可以支持大腦組織在阻塞的左側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)域的存活（圖5c）。同時(shí)，4T-BSA納米探針的流動(dòng)可用于評(píng)估與動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)相關(guān)的血流灌注動(dòng)態(tài)（圖5e）?；贛CAO模型大腦中動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)血流網(wǎng)絡(luò)演變的上述血流灌注研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)在動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的最大開(kāi)通至少維持了65分鐘（圖5e），從而在急性缺血性疾病期間確保足夠的血流以支持大腦的存活。

在CVST模型中，可以輕松測(cè)量靜脈竇阻塞部位周圍的腦靜脈側(cè)支循環(huán)灌注（圖5f）。仔細(xì)觀察在注射4T-BSA納米探針后30分鐘內(nèi)的連續(xù)放大NIR-IIa圖像，清楚地檢測(cè)到在阻塞的靜脈竇區(qū)域上方有許多復(fù)雜側(cè)支吻合發(fā)育（圖5g）。此外，發(fā)現(xiàn)多個(gè)側(cè)支連接從血栓周圍的腦血管（矢狀竇的中后區(qū)域）移動(dòng)到矢狀竇的前區(qū)域（圖5g中的白色和藍(lán)色箭頭）。綜合來(lái)看，4T-BSA納米探針的NIR-IIa成像可以闡明側(cè)支血流灌注的高分辨率連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。對(duì)相同血管和吻合區(qū)域的橫截面強(qiáng)度輪廓進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步證實(shí)了阻塞靜脈竇區(qū)域周圍的腦靜脈側(cè)支循環(huán)灌注（圖5h）。

參考文獻(xiàn)

Chen S, Chen H, Li X, et al. Dynamic Pathophysiological Insight into the Brain by NIR‐II Imaging[J]. Advanced Science, 2025: 2416390.

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