一、拉曼光譜技術(shù)在細(xì)菌研究方面的主要應(yīng)用類型

       細(xì)菌存在于生活的方方面面，醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、考古等多領(lǐng)域均將其作為重要研究?jī)?nèi)容之一。拉曼光譜是一種指紋光譜技術(shù)，能夠快速獲取樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。因此能夠被應(yīng)用于細(xì)菌分類、細(xì)菌篩選、細(xì)菌耐藥性、細(xì)菌分泌物等研究。

1、細(xì)菌分類和細(xì)菌篩選

       拉曼對(duì)細(xì)菌分類很好理解，不同細(xì)菌具有不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分，拉曼光譜能夠區(qū)分出細(xì)菌組成的化學(xué)類型或其含量比例的不同。一般情況下，細(xì)菌的結(jié)構(gòu)很類似，肉眼難以直接判斷其類型，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)快速細(xì)菌分類。相對(duì)于傳統(tǒng)方法需要培養(yǎng)數(shù)天細(xì)菌再進(jìn)行鑒別，此方法效率提高數(shù)十倍。

                     

                       Identification of bacteria in drinking water with Raman spectroscopy，Anal. Methods, 2013

                       當(dāng)我們將各類細(xì)菌的拉曼光譜建立成數(shù)據(jù)庫(kù)，利用拉曼+光鑷+微流控協(xié)同體系，即可進(jìn)行細(xì)菌的但單細(xì)胞篩選。

                  

                     Raman-Activated Cell Sorting Based on Dielectrophoretic Single-Cell Trap and Release.nal. Chem. 2015

                     Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. colivia ramanome，Scientific RepoRts ,2016

       不同細(xì)菌、相同細(xì)菌在不同發(fā)育時(shí)期，其化學(xué)結(jié)構(gòu)及其含量比例，由此可延申研究細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育分期、外部環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)菌分化等各類研究，在此不一一贅述。

2、細(xì)菌耐藥性

       利用拉曼技術(shù)篩選有效藥物是目前（成）熟和（有）效的拉曼-細(xì)菌應(yīng)用類型。通過給細(xì)菌飼喂帶有氘原的葡萄糖營(yíng)養(yǎng)液，如果細(xì)菌耐藥，則氘原子代謝到細(xì)菌細(xì)胞中，在2200cm-1處出現(xiàn)明顯的D-O峰，區(qū)別于H-O鍵，此范圍屬于俗稱的拉曼靜默區(qū)，能夠很靈敏的判別。利用這一技術(shù)，不到1小時(shí)即能夠判斷藥物對(duì)細(xì)菌是否有致死作用。

                

                  Rapid Antibiotic Susceptibility Testing of Pathogenic Bacteria Using Heavy-Water-Labeled Single-Cell Raman Spectroscopy in Clinical Samples，Anal. Chem. 2019

二、細(xì)菌研究對(duì)拉曼光譜儀設(shè)備有哪些主要要求？

       從上面的內(nèi)容得知，拉曼研究細(xì)菌具有非常好的辨識(shí)度，成熟可靠，那么是不是任何一臺(tái)拉曼都能夠用于細(xì)菌測(cè)量呢？答案是否定的。那么細(xì)菌研究對(duì)拉曼選擇有哪些核心要求呢，我們分析細(xì)菌研究的特點(diǎn)后即可豁然開朗。

1、細(xì)菌尺寸很小。多數(shù)細(xì)菌的尺寸在10-100微米范圍內(nèi)，部分細(xì)菌可小至2微米升值1微米以下。由此對(duì)拉曼的首要需求——小聚焦光斑。因此要求拉曼光譜儀要對(duì)激發(fā)光束進(jìn)行整形、同時(shí)盡可能選擇高倍物鏡，以達(dá)到將聚焦光斑控制在細(xì)菌體積范圍內(nèi)。如下右圖為我司研發(fā)的DeepBlue系列共聚焦拉曼光譜系統(tǒng)的聚焦光斑實(shí)測(cè)圖像，100倍物鏡聚焦光斑<1微米。小的聚焦光斑還具有的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)：即激光功率密度大，拉曼激發(fā)效率高，也保證了系統(tǒng)的靈敏度。這也就解釋了很難看到手持式或光纖探頭拉曼能夠?qū)渭?xì)胞的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)試。

                 

                             左圖來自于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系作者刪除。

2、細(xì)菌多數(shù)是光學(xué)透明的。光學(xué)透明意味著拉曼的激發(fā)光很容易穿透細(xì)菌并照射到細(xì)菌的培養(yǎng)皿，則培養(yǎng)皿的拉曼信號(hào)容易干擾細(xì)菌拉曼測(cè)試。這種特點(diǎn)對(duì)拉曼光譜儀的Z軸的共聚焦性能也提出了更高的要求。通過減小針孔尺寸壓制聚焦光斑以外的拉曼信號(hào)，獲得高信噪比拉曼光譜數(shù)據(jù)。

3、細(xì)菌體系可能帶有熒光。細(xì)菌作為生物體會(huì)包含熒光特性的氨基酸（如色氨酸等）或其他熒光分泌物，另一方面，培養(yǎng)基材料的類別或純度也很有可能帶入熒光。因此選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)也是非常關(guān)鍵的一環(huán)。如果細(xì)菌體系無熒光，優(yōu)選532nm等短波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)試信號(hào)強(qiáng)，測(cè)試速度也快。如果確有熒光則需要選擇785nm或1064nm等長(zhǎng)波激發(fā)，或針對(duì)研究體系選擇專門的激發(fā)波長(zhǎng)，避開熒光干擾（如下示意圖）。

                

                     上圖為示意圖，不適合所有類型樣品，熒光特性由樣品本身決定，需要進(jìn)行單獨(dú)考察

4、其他因素。拉曼系統(tǒng)的通光效率、雜散光抑制能力，光譜分辨率、探測(cè)器溫度，光譜測(cè)量范圍等因素也會(huì)影響到細(xì)菌測(cè)量。其中通光效率+雜散光抑制能力=系統(tǒng)的靈敏度更為重要，直接影響了測(cè)試結(jié)果是否可用。系統(tǒng)靈敏度另外闡述，此文暫不涉及。

三、DeepBLUE200共聚焦顯微拉曼光譜儀細(xì)菌樣品實(shí)測(cè)效果

       1、樣品來源：成都生物所

       2、樣品種類：大腸桿菌？

       3、樣品數(shù)量：2

       4、測(cè)試條件：

  注：本次測(cè)試設(shè)備部件均為國(guó)產(chǎn)，光譜儀更換為進(jìn)口型號(hào)，效果更好。

       5、樣品處理辦法和測(cè)量過程:

            5.1 用鑷子將培養(yǎng)皿中的樣品挑取到中空金屬支架上，使測(cè)試區(qū)域懸空；

            5.2 白光反射照明+CCD相機(jī)+10X物鏡尋找和觀察目標(biāo)細(xì)菌；

            5.3 切換至100X物鏡，聚焦清晰；

            5.2 點(diǎn)擊控制器，白光制動(dòng)切換至激光光路，激光照射到樣品上，開始測(cè)量；

       6、測(cè)試結(jié)果

            

        以上獲得了清晰的細(xì)菌拉曼光譜數(shù)據(jù)，兩種細(xì)菌區(qū)分有明顯的拉曼峰位，達(dá)到了用戶目標(biāo)要求。相對(duì)用戶此前采用本單位拉曼測(cè)試結(jié)果（如下兩圖），DeepBlue200的效果非常明顯。

                    

                      細(xì)菌1（明顯的背景信號(hào)，無細(xì)菌拉曼信號(hào)）

                       

                     細(xì)菌2（明顯的培養(yǎng)皿塑料拉曼信號(hào)，無細(xì)菌信號(hào)）

四、儀器推薦

                   

      DeepBlue200是一款高性能全自動(dòng)激光共聚焦顯微拉曼成像光譜儀，用于固體液體樣品的拉曼光譜測(cè)量，用于體相材料的拉曼光譜掃描成像。特點(diǎn)如下：

      自動(dòng)化：自動(dòng)切換白光/激光光路，自動(dòng)切換激發(fā)波長(zhǎng)、自動(dòng)選擇激光功率。

      高靈敏：真共焦設(shè)計(jì)，極簡(jiǎn)光路，高雜散光抑制能力無懼硅三階峰信噪比挑戰(zhàn)，直面激光不耐受和拉曼信號(hào)弱等難測(cè)樣品的考驗(yàn)，如薄膜、小顆粒和稀溶液樣品。

      穩(wěn)定性：主要力學(xué)結(jié)構(gòu)件和光機(jī)部件均采用高強(qiáng)度合金材料，結(jié)構(gòu)力學(xué)重心下移光學(xué)部件剛性耦合，儀器具有極（佳）的穩(wěn)定性，抗環(huán)境擾動(dòng)能力強(qiáng)。

      靈活性：DeepBlue200可采用全國(guó)產(chǎn)光學(xué)部件，為用戶提供低成本高性能解決方案，滿足大多數(shù)用戶需求；DeepBlue200也可集成HORIBA光譜儀和XYZ掃描平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)高光譜分辨率、高空間分辨率和大樣本自動(dòng)分析等高級(jí)功能。