前言  

       由氨基酸組成的蛋白質(zhì)和多肽是生命科學(xué)研究中必涉及的研究對象，作為生命體組成的基本單元之一，其研究深度和廣度也是超出很多人的想象。其涉及到生物醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、制藥等多領(lǐng)域。當(dāng)前，很多技術(shù)被用于分析蛋白和多肽，如氨基酸分析儀、圓二色光譜儀、拉曼光譜儀、XRD、FTIR、核磁共振、ITC、冷凍電鏡、SPR蛋白質(zhì)相互作用等。拉曼光譜能夠快速獲取物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，對于蛋白和多肽研究，拉曼光譜技術(shù)有其自身優(yōu)勢，也有明顯的局限性，需要根據(jù)實(shí)際情況來選擇。

一、拉曼光譜技術(shù)在蛋白多肽分析領(lǐng)域的優(yōu)勢

1、主要優(yōu)勢——指紋光譜技術(shù)應(yīng)用與蛋白多肽二級結(jié)構(gòu)分析

       拉曼對分子化學(xué)鍵非常敏感，因此能夠用來分析蛋白多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括二級結(jié)構(gòu)。如下圖1為蛋白質(zhì)的典型拉曼光譜曲線，對照如下標(biāo)記峰位，可以快速讀出所測蛋白的各組分組成及其含量。其中1000cm-1指向了苯丙氨酸，508cm-1指向S-S鍵；1600-1700cm-1為 Amide I帶，1200-1400cm-1 為Amide III帶，可計算解析α-helix、β-strand、Random coil等蛋白多肽的二級結(jié)構(gòu)。Amide I帶相對于Amide III帶光譜更為清晰且容易擬合，因此多數(shù)報道采用Amide I帶的擬合結(jié)果。拉曼光譜在辨析化學(xué)結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)勢可延伸出很多相關(guān)應(yīng)用，如蛋白質(zhì)變性（食品加工）、蛋白質(zhì)相互作用（生命科學(xué)）、蛋白質(zhì)微環(huán)境（溶劑效應(yīng)）等。

                

                               圖1. 典型蛋白質(zhì)指紋區(qū)拉曼光譜曲線

                

                              圖2. Amide I帶的解析計算蛋白二級結(jié)構(gòu)比例

2、其他優(yōu)勢——無損和快速

       拉曼為光激發(fā)散射現(xiàn)象，一般采用532nm、785nm等非紫外光激發(fā)，因此對樣品基本無損，可適用于蛋白溶液、生物細(xì)胞組織等各種體系的直接測量。測試時間一般為秒級，部分樣品短只0.1秒，相對于氨基酸分析儀、CD和冷凍電鏡等蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，測試效率非常明顯。

另外，相對于紅外光譜，水對拉曼信號的干擾相對較小，因此拉曼光譜允許活體細(xì)胞等含蛋白組分的樣品分析。

二、拉曼光譜技術(shù)在蛋白多肽分析領(lǐng)域的局限性

1、主要局限性——拉曼光譜技術(shù)不合適分析低濃度和復(fù)雜混合樣品

       拉曼散射的效率極低，為10-6級別，也就是10萬個光子照射樣品才會出現(xiàn)幾個拉曼散射光子信號。因此拉曼光譜技術(shù)非常適合分析半導(dǎo)體、碳材料、高分子材料、無機(jī)金屬氧化物等高純和高濃度的樣品。實(shí)際生產(chǎn)中，大部分蛋白在溶液或在生物體中都是微量存在，并且混入了多糖、核酸等其他生物活性物質(zhì)。采用拉曼技術(shù)測量的信號會很弱，需要長積分時間。

       因此，對于蛋白多肽的拉曼測試，提高溶液濃度或選擇具有局部高濃度的樣品會獲得更有利的測試結(jié)果。常規(guī)來說，蛋白多肽溶液的濃度應(yīng)該大于1%，最(好)能達(dá)到5%以上，盡量純化樣品有利于準(zhǔn)確解析蛋白結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，對于膠原蛋白、生物藥這類固體粉末或則高濃度純蛋白多肽樣品，是極(好)的拉曼測試樣品，拉曼信號很強(qiáng)。對于諸如細(xì)胞、動物組織等局部蛋白高濃度樣品也是非常適合拉曼的，采用高倍物鏡將光斑聚焦到微米級，能夠獲得高分辨率的細(xì)胞（組織）蛋白空間成像。如下圖細(xì)胞拉曼成像，細(xì)胞尾巴（藍(lán)色）組成為蛋白，通過拉曼掃描成像能夠清晰的辨別各組分的空間分布。

                  

2、其他局限性-拉曼成像速度慢

       如上所述，大多數(shù)含蛋白多肽樣品（細(xì)胞或動物組織）的拉曼信號較弱，拉曼測量時單點(diǎn)積分時間會比較長，如10秒甚至更長。細(xì)胞或動物組織本身又精細(xì)的結(jié)構(gòu)，需要共聚焦拉曼進(jìn)行高分辨率掃描，步進(jìn)甚至要求達(dá)到0.5微米，按此計算，掃描1個10微米直徑的小型細(xì)胞，也需要超過1個小時。對于尺寸達(dá)到厘米級動物組織或器官，將是巨量時間，已經(jīng)無實(shí)用價值。為了解決拉曼成像速度慢的問題，科學(xué)家研發(fā)出了受激拉曼和相干拉曼，拉曼成像速度可提高上萬倍。該技術(shù)需采用兩束飛秒激光器，因此設(shè)備極其昂貴，在此提供一張美圖，細(xì)節(jié)不再詳述。

三、蛋白多肽樣品對拉曼光譜儀設(shè)備有哪些主要要求？

（1）儀器的靈敏度

       由以上得知，蛋白多肽拉曼測試的核心問題是信號強(qiáng)度問題，在樣品濃度無法提升的情況下，儀器靈敏度越高越有利于該類樣品測試。儀器靈敏度由多因素組成，激光功率、激發(fā)/收集光學(xué)系統(tǒng)效率，探測器效率等。共聚焦拉曼光譜儀一般采用測量單晶硅三階峰來衡量，將另文介紹。

（2）光譜分辨率

       蛋白多肽由數(shù)個至數(shù)萬個氨基酸組成，內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，因此拉曼光譜的峰位重疊現(xiàn)象非常明顯，以上介紹和文獻(xiàn)檢索都能看到，蛋白多肽的拉曼光譜有大量拉曼峰位相互交疊而成，采用高光譜分辨率拉曼更有利于解析蛋白多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

（3）掃描成像功能

       除非是生物制藥企業(yè)等測量固定高純度樣品或僅研究液體蛋白多肽樣品，一般需要配置掃描成像功能，便于研究生物體不同區(qū)域蛋白多肽的結(jié)構(gòu)及其變化。

（4）激發(fā)波長選擇

       波長選擇是拉曼光譜儀器選型的必修課，蛋白多肽存在色氨酸等發(fā)光基團(tuán)，一套用于蛋白多肽測量的拉曼最(好)能配置2個波長（一般推薦532nm和785nm），以便適用于更多這類樣品的分析。

              

       上圖為示意圖，不適合所有類型樣品，熒光特性由樣品本身決定，需要進(jìn)行單獨(dú)考察

四、DeepBlue200共聚焦顯微拉曼光譜儀蛋白實(shí)測效果

       1、樣品：多肽溶液

       2、樣品數(shù)量：5

       3、測試條件：

             4.1用移液器將多肽溶液滴在中空金屬支架上的保險膜上（保鮮膜可用手指按壓一下形成凹陷），盡量使液體成半球狀，厚度大于3mm；

             4.2 使用50X長焦物鏡；

             4.3 啟動拉曼實(shí)時采集功能，觀察樣品拉曼信號，在最(強(qiáng))處停止，增加積分時間至10 s，記錄每個樣品的拉曼光譜 ；

       5、測試結(jié)果

          

                多肽溶液全拉曼光譜曲線

              其中2個樣品的Amide I帶拉曼光譜曲線擬合

        以上獲得了清晰的多肽拉曼光譜數(shù)據(jù)，不同樣品拉曼光譜特征明顯，達(dá)到了用戶區(qū)分多肽二級結(jié)構(gòu)的要求。

五、儀器推薦

DeepBlue200是一款高性能全自動激光共聚焦顯微拉曼成像光譜儀，用于固體液體樣品的拉曼光譜測量，用于體相材料的拉曼光譜掃描成像。特點(diǎn)如下：

自動化：自動切換白光/激光光路，自動切換激發(fā)波長、自動選擇激光功率。

高靈敏：真共焦設(shè)計，極簡光路，高雜散光抑制能力無懼硅三階峰信噪比挑戰(zhàn)，直面激光不耐受和拉曼信號弱等難測樣品的考驗(yàn)，如薄膜、小顆粒和稀溶液樣品。

穩(wěn)定性：主要力學(xué)結(jié)構(gòu)件和光機(jī)部件均采用高強(qiáng)度合金材料，結(jié)構(gòu)力學(xué)重心下移光學(xué)部件剛性耦合，儀器具有極(佳)的穩(wěn)定性，抗環(huán)境擾動能力強(qiáng)。

靈活性：DeepBlue200可采用全國產(chǎn)光學(xué)部件，為用戶提供低成本高性能解決方案，滿足大多數(shù)用戶需求；DeepBlue200也可集成進(jìn)口高(端)光譜儀和XYZ掃描平臺，實(shí)現(xiàn)高光譜分辨率、高空間分辨率和大樣本自動分析等高級功能。