多色流式抗體技術(shù)組成：三大核心要素

1.抗體

特異性：抗體的核心，決定了你檢測(cè)的是什么靶蛋白（如CD3、CD4、CD8、CXCR5等）。通常是單克隆抗體，有明確的克隆號(hào)。

宿主來源：主要是小鼠、大鼠、兔等。在設(shè)計(jì)多色panel時(shí)，需避免二抗引起的交叉反應(yīng)。

形式：完整抗體、F(ab‘)?片段（減少Fc受體非特異性結(jié)合）等。

2.熒光素

這是實(shí)現(xiàn)“多色"的關(guān)鍵。熒光素受到特定波長的激光激發(fā)后，會(huì)發(fā)射出特定波長的熒光。

儀器配置：必須匹配流式細(xì)胞儀的激光器（如488nm藍(lán)、640nm紅、355nm紫外等）和檢測(cè)濾光片。

抗原表達(dá)水平：高表達(dá)的抗原（如CD45）用較弱熒光素；低表達(dá)的抗原（如某些細(xì)胞因子、趨化因子受體）用強(qiáng)熒光素（如PE、APC）。

光譜重疊（溢漏）：不同熒光素的發(fā)射光譜會(huì)有重疊，需要進(jìn)行熒光補(bǔ)償。

3.抗體-熒光素偶聯(lián)物

通過化學(xué)方法將熒光素穩(wěn)定地共價(jià)連接到抗體上，形成最終的檢測(cè)工具。

多色流式抗體 Horizon™ BV421 Mouse Anti-Human CD3

對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞上 CD3 表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析（左圖）。用 Horizon™ BV421 鼠抗人 CD3 抗體（貨號(hào) 562426/562427；實(shí)線直方圖）或 Horizon™ BV421 鼠 IgG1, κ 同型對(duì)照（貨號(hào) 562438；虛線直方圖）對(duì)人全血進(jìn)行染色。用  Pharm Lyse™ 裂解緩沖液（貨號(hào) 555899）裂解紅細(xì)胞。熒光直方圖由具有活淋巴細(xì)胞前向和側(cè)向光散射特征的事件得出。流式細(xì)胞術(shù)使用  FACSCanto™ II 流式細(xì)胞儀系統(tǒng)進(jìn)行。
人扁桃體細(xì)胞內(nèi) CD3 表達(dá)的免疫組織熒光分析（右圖）。將人扁桃體冷凍切片（5 微米）用  Cytofix™ 固定緩沖液（貨號(hào) 554655）固定，用 5% 羊血清和 1% BSA 稀釋于 1×PBS 中進(jìn)行封閉，然后用  Pharmingen™ 純化小鼠抗人 CD11c 抗體（貨號(hào) 565805）染色，再用  Horizon™ BV480 山羊抗小鼠 Ig 二抗（貨號(hào) 564877，偽彩綠色）染色。切片徹·底清洗后，用  Horizon™ BV421 小鼠抗人 CD3 抗體（貨號(hào) 562426/562427，偽彩紅色）和 Alexa Fluor® 488 小鼠抗人 CD19 抗體（貨號(hào) 557697，偽彩藍(lán)色）染色。圖像在標(biāo)準(zhǔn)的落射熒光顯微鏡上采集。原始放大倍數(shù)為 20 倍。

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