單細(xì)胞測(cè)試分析系統(tǒng)

單細(xì)胞測(cè)試分析系統(tǒng)      流式單細(xì)胞力學(xué)儀器

德國(guó)Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細(xì)胞力學(xué)流式分析系統(tǒng)

研發(fā)背景

1 研究細(xì)胞力學(xué)在臨床有什么意義？ 如何區(qū)分不同果實(shí)的成熟度？

解決方案：施加適當(dāng)?shù)牧Σ⒏袘?yīng)水果的機(jī)械特性，將清楚地向您展示成熟和過(guò)熟的獼猴桃之間的區(qū)別。

這是否也適用于較小的水果組織碎片？如果我們下降到單細(xì)胞水平怎么辦？

細(xì)胞的機(jī)械特性由功能上重要的細(xì)胞成分控制，例如細(xì)胞骨架。它們構(gòu)成了一種新興的無(wú)標(biāo)記生物標(biāo)志物，可以直接了解細(xì)胞功能或功能障礙。因此，機(jī)械特性有助于理解和評(píng)估藥物治療效果、免疫細(xì)胞活化、干細(xì)胞分化、癌癥預(yù)后或培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)和質(zhì)量的評(píng)估。

   細(xì)胞變形能力與細(xì)胞的狀況和功能相關(guān)。

   無(wú)需標(biāo)記即可評(píng)估細(xì)胞變形能力。

   應(yīng)用潛力巨大。

細(xì)胞力學(xué)構(gòu)成了研究從發(fā)育到疾病的主題的關(guān)鍵科學(xué)目標(biāo)。

2 為什么采用單細(xì)胞流式分析？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業(yè)大學(xué)使用 AFM 和光學(xué)拉伸來(lái)揭示細(xì)胞力學(xué)與細(xì)胞功能（或功能障礙）之間的相關(guān)性。這些方法的一個(gè)主要障礙是低通量（多 100 個(gè)細(xì)胞/小時(shí)）。測(cè)量過(guò)程為：找到一個(gè)細(xì)胞，停止施力，整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后釋放細(xì)胞，分析測(cè)量參數(shù)。為了克服耗時(shí)的步驟，于是他們開(kāi)發(fā)了一種使用具有連續(xù)力和動(dòng)態(tài)分析的連續(xù)流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實(shí)施了這個(gè)想法。從那時(shí)起，已經(jīng)發(fā)表了許多具有高影響力的科學(xué)論文，并且技術(shù)開(kāi)始普及。

現(xiàn)在可以同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理特性和熒光信號(hào) (RT-FDC)，從而可以將細(xì)胞的物理特性與細(xì)胞生物學(xué)的黃金標(biāo)準(zhǔn)（熒光流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)。近還可以沿通道動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞變形并研究變形的時(shí)間相關(guān)動(dòng)力學(xué) (dRT-DC)。

技術(shù)原理

1 如何高速的壓縮單個(gè)細(xì)胞？

為了產(chǎn)生確定的力，孤立的細(xì)胞被泵送通過(guò)橫截面略大于細(xì)胞橫截面的微通道。周?chē)黧w的壓力梯度產(chǎn)生流動(dòng)剖面并使細(xì)胞流體動(dòng)力學(xué)變形。流體的流速和粘度控制作用在細(xì)胞上的力。

細(xì)胞可以通過(guò)流體動(dòng)力變形。

力由流速和粘度控制。

較軟的細(xì)胞顯示較大的變形。

RT-DC 中的“實(shí)時(shí)"來(lái)自于拍攝圖像時(shí)對(duì)細(xì)胞輪廓的即時(shí)分析。

細(xì)胞面積、高度、寬度、縱橫比等的立即計(jì)算允許對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行即時(shí)觀察和選通。

該算法還計(jì)算細(xì)胞的亮度和亮度偏差等參數(shù)，從而深入了解形態(tài)學(xué)特性。

系統(tǒng)保存每個(gè)檢測(cè)到的事件圖像，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細(xì)胞。

3 如何表征力進(jìn)而計(jì)算楊氏模量？

用于高通量細(xì)胞變形測(cè)量的微流體方法的比較

細(xì)胞的機(jī)械表型是其狀態(tài)和功能的固有生物物理標(biāo)記，在基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究中有許多應(yīng)用?；谖⒘黧w的方法使單細(xì)胞機(jī)械表型分析的吞吐量可與流式細(xì)胞術(shù)相媲美。在這里，我們提出了一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化的跨實(shí)驗(yàn)室研究，比較了三種基于微流體的測(cè)量細(xì)胞機(jī)械表型的方法：基于收縮的變形細(xì)胞術(shù) (cDC)、剪切流變形細(xì)胞術(shù) (sDC) 和拉伸流變形細(xì)胞術(shù) (xDC)。所有三種方法都檢測(cè)由暴露于改變的滲透壓引起的細(xì)胞變形性變化。然而，僅在 cDC 和 sDC 中檢測(cè)到 latrunculin B 誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白分解后的劑量依賴(lài)性變形能力增加，這表明當(dāng)將細(xì)胞暴露于 xDC 施加的更高應(yīng)變率時(shí)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以外的細(xì)胞成分主導(dǎo)反應(yīng)。這里提出的直接比較進(jìn)一步加深了我們對(duì)不同變形性細(xì)胞術(shù)方法的適用性的理解，并為解釋使用不同平臺(tái)執(zhí)行的變形性測(cè)量提供了背景。

實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀：動(dòng)態(tài)細(xì)胞機(jī)械表型分析

我們引入了實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀 (RT-DC)，用于對(duì)大量細(xì)胞（>100,000 個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行連續(xù)細(xì)胞力學(xué)表征，分析速率大于 100 個(gè)細(xì)胞/秒。RT-DC 對(duì)細(xì)胞骨架的改變很敏感，可以區(qū)分細(xì)胞周期階段，跟蹤干細(xì)胞分化成不同的譜系，并通過(guò)其機(jī)械指紋識(shí)別全血中的細(xì)胞群。該技術(shù)為流式細(xì)胞術(shù)增加了一個(gè)新的無(wú)標(biāo)記維度，在生物學(xué)、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中具有多種應(yīng)用。

對(duì)干細(xì)胞衍生紅細(xì)胞的機(jī)械特性進(jìn)行高通量評(píng)估，以進(jìn)行細(xì)胞下游加工

每年，在 176 個(gè)國(guó)家的 13000 多個(gè)血液中心收集了大約 1.125 億次獻(xiàn)血。然而，世界衛(wèi)生組織每年都會(huì)報(bào)告供輸血使用的安全獻(xiàn)血短缺，這主要是由于有資格獻(xiàn)血的人數(shù)減少以及血液長(zhǎng)期儲(chǔ)存的技術(shù)限制。因此，迫切需要易于管理的紅細(xì)胞 (RBC) 替代來(lái)源，其中一種選擇是用干細(xì)胞制造它們。Giarratana等人在 2011 年將人造紅細(xì)胞 (mRBC) 積極驗(yàn)證為潛在的臨床產(chǎn)品。已經(jīng)使用胚胎干細(xì)胞在體外產(chǎn)生了潛在的可輸血紅細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，來(lái)自骨髓或臍帶血的 CD34+ 細(xì)胞，以及近一種永生化的成人紅細(xì)胞系（布里斯托紅系成人 BEL-A ) . 然而，目前使用的差異化協(xié)議并不是 100% 有效的。具體來(lái)說(shuō)，該協(xié)議的終產(chǎn)品是一種異質(zhì)細(xì)胞混合物，不僅包含功能齊全的去核 mRBC，還包含在去核過(guò)程中排出的自由浮動(dòng)核和未分化的有核細(xì)胞。殘留的干細(xì)胞、部分分化的細(xì)胞和細(xì)胞核的存在，如果注射到患者體內(nèi)會(huì)帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)于 mRBC 和其他細(xì)胞療法而言，必須通過(guò)開(kāi)發(fā)適當(dāng)?shù)募兓?/span>程序來(lái)緩解這一嚴(yán)重問(wèn)題. 傳統(tǒng)上，靶細(xì)胞分離是通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 和磁激活細(xì)胞分選 (MACS) 進(jìn)行的。這兩種技術(shù)都非常具體，因?yàn)樗鼈兝梅肿由飿?biāo)志物，但需要添加昂貴的修飾劑，如抗體或 DNA 染色劑，以及單獨(dú)的質(zhì)量控制過(guò)程。此外，這些技術(shù)的通量是有限的（例如，本研究中使用的 FACS 儀器每小時(shí)10⁷ 個(gè)細(xì)胞），工業(yè)上可行的技術(shù)需要具有成本效益、自動(dòng)化和可擴(kuò)展的方法. 文獻(xiàn)中提出了各種無(wú)標(biāo)記方法，但尚未達(dá)到商業(yè)測(cè)試階段：聲泳、磁泳、光學(xué)方和被動(dòng)分選。被動(dòng)分選（例如慣性聚焦、夾流分級(jí)、確定性橫向位移和過(guò)濾）利用了設(shè)備設(shè)計(jì)的特性，并且除了液體泵送系統(tǒng)之外，它們不需要任何其他外力。這些系統(tǒng)具有許多潛在優(yōu)勢(shì)，例如減少樣品處理步驟的數(shù)量（例如. 通過(guò)減少染色/洗滌步驟），相對(duì)高的通量和效率（> 90%）。然而，在這種類(lèi)型的系統(tǒng)中，分類(lèi)純粹是由內(nèi)源性細(xì)胞特性（如大小和可變形性）促進(jìn)的，需要進(jìn)一步的證據(jù)來(lái)量化細(xì)胞機(jī)械類(lèi)型，以克服目前缺乏對(duì)例如 mRBC 機(jī)械特性34的知識(shí)，并確定潛在的基于機(jī)械型的分類(lèi)。變形性正在成為一種新的同質(zhì)性標(biāo)記，可用于識(shí)別復(fù)雜細(xì)胞樣本中的亞群，例如 mRBC. 然而，雖然定性觀察已經(jīng)注意到整個(gè) CD34+ 細(xì)胞分化方案中的表型變化，但對(duì)其機(jī)械表型變化知之甚少。本文報(bào)告了對(duì)這些變化的次廣泛的定量分析，結(jié)合了高通量微流體和傳統(tǒng)的生物物理表征。具體來(lái)說(shuō)，我們次表征了臍帶血 CD34+在體外進(jìn)行的機(jī)械分型分化為紅細(xì)胞，重點(diǎn)關(guān)注四個(gè)關(guān)鍵階段。收集的數(shù)據(jù)使用實(shí)時(shí)變形細(xì)胞儀 (RT-DC)、原子力顯微鏡 (AFM) 和明場(chǎng)/熒光成像來(lái)確定去核細(xì)胞、有核細(xì)胞和自由浮動(dòng)細(xì)胞核的大小和可變形性。此外，對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行染色，以研究這些因素對(duì)觀察到的機(jī)械典型變化的潛在貢獻(xiàn)。