本文要點：雙鎖探針因其增強的特異性和多重檢測能力，在醫(yī)學診斷和藥物篩選中具有應用前景。然而，目前用于雙鎖系統(tǒng)的大多數(shù)近紅外（NIR）熒光團在NIR窗口的藍區(qū)（650–800 nm）表現(xiàn)出光譜活性，嚴重限制了其在深層組織成像中的應用。在此，報道了一類新型深NIR至NIR-II半花青熒光團（Guilin，GL）骨架，其具備雙光學校準位點，適用于雙鎖探針的開發(fā)。這些GL染料通過氯取代的花青/半花青雜化獲得，發(fā)射波長覆蓋800–950 nm，并含有關鍵的meso-Cl及羥基/氨基基團，可便捷地轉(zhuǎn)化為兩個不同的反應位點，用于多重成像分析。為驗證GL染料的適用性，研究者設計了一種新型雙鎖探針GL-Cys，其在低半胱氨酸（Cys）濃度下于830 nm處表現(xiàn)出增強發(fā)射，而在高濃度下則出現(xiàn)顯著的765 nm信號升高。更重要的是，GL-Cys探針可通過體內(nèi)雙通道比率成像，有效區(qū)分胰腺/乳腺癌模型及相應腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異。因此，這一分子設計范式建立了一種通用的深NIR至NIR-II半花青骨架，可推廣用于其他分析物的多路成像。

動物活體成像系統(tǒng)

方案1. 創(chuàng)新型深近紅外到近紅外二區(qū)半花菁熒光團庫，具有雙光學可調(diào)位點，用于雙鎖定探針的開發(fā)

本研究引入一系列創(chuàng)新的深NIR至NIR-II半花青熒光團（命名為Guilin，GL），其整合了雙光學校準位點，為雙鎖探針的開發(fā)建立了一個通用平臺（方案1）。所設計的GL染料通過經(jīng)典的氯取代花青/半花青雜化方法，發(fā)射波長范圍為800–950 nm，并含有關鍵的meso-Cl及羥基/氨基官能團，可實現(xiàn)多重成像分析。基于這些熒光團骨架，研究者構(gòu)建了一種新型雙鎖探針GL-Cys，其光譜響應隨半胱氨酸（Cys）濃度變化而切換：在低Cys濃度下于830 nm處表現(xiàn)出增強發(fā)射，而在高Cys濃度下則出現(xiàn)765 nm信號的顯著升高。至關重要的是，GL-Cys探針能夠有效區(qū)分胰腺/乳腺癌小鼠模型及相應腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團在多重生物分析應用中的潛力。

圖1 . GL的合成路線、熒光光譜和DFT計算

雜化通常是賦予熒光團互補性和多功能性的關鍵分子工程策略。為了獲得具有雙光學校準位點的深NIR至NIR-II熒光團，研究者嘗試將氯取代的花青與半花青進行雜化，從而產(chǎn)生一類新型的NIR染料（GL-1–8），其含有氯和羥基/氨基光學校準基團。GL-1–8染料通過經(jīng)典的半花青合成方法以良好產(chǎn)率合成，本研究中使用的GL-1–8合成路線如圖1a所示。所有化合物均通過核磁共振（NMR）光譜（1H和13C）和高分辨率質(zhì)譜進行了驗證。

接下來，本文測定了GL-1–8在不同溶劑（包括CH?Cl?、CH?OH、MeCN和MeCN/PBS（1:1（v/v）；pH=7.4））中的光物理性質(zhì)。GL-1–8染料在MeOH中的吸收峰分別位于766、799、780、824、753、764、853和869 nm。相應地，這些染料在深NIR和NIR-II區(qū)域也表現(xiàn)出強熒光，發(fā)射峰分別位于825、827、832、839、920、923、927和936 nm，表明其在深層組織成像中的潛力（圖1b和c）。為了提供理解不同供體和受體對光譜位移影響的理論基礎。密度泛函理論（DFT）計算顯示，GL-1–8的能隙從2.047 eV逐漸減小到1.759 eV，與實驗光譜數(shù)據(jù)吻合良好（圖1f）。

為了支持GL-1–8染料具有雙光學校準位點的設計概念，研究者分別驗證了meso-Cl和羥基/氨基官能團的光學調(diào)諧能力。首先，將這些染料置于一系列pH水平下，以模擬酚類化合物的質(zhì)子化和去質(zhì)子化。如預期，GL-1–6（圖1d、e和S4）在不同pH條件下的發(fā)射光譜表現(xiàn)出以λ=820–940 nm為中心的熒光帶增加，以及以λ=740–860 nm為中心的熒光帶減少。此外，吸收光譜也顯示出pH誘導的波長位移。

方案2 . 用于腫瘤小鼠模型和相應腫瘤鐵死亡模型中半胱氨酸（Cys）水平雙通道區(qū)分的雙鎖熒光探針示意圖。

圖2. GL-Cys檢測不同Cys濃度的研究

為探究GL-Cys區(qū)分檢測半胱氨酸（Cys）的可行性，評估了GL-Cys與Cys反應過程中吸收光譜的變化（圖2）。當加入低濃度Cys（0–60 μM）時，GL-Cys溶液在610 nm處的吸光度逐漸降低；隨后，在810 nm處出現(xiàn)新的吸收帶，在830 nm處出現(xiàn)新的發(fā)射帶，溶液顏色由藍色逐漸變?yōu)榫G色（圖2a和c）。值得注意的是，過量Cys的加入導致吸收光譜發(fā)生顯著藍移，從810 nm移至645 nm，同時溶液顏色由綠色變?yōu)榍嗑G色。在Cys濃度60–350 μM范圍內(nèi)，765 nm處的熒光強度逐步增強（圖2d）。值得注意的是，GL-Cys的熒光強度與Cys濃度（0–10 μM）之間呈現(xiàn)顯著線性相關性。基于熒光光譜，GL-Cys對Cys的檢測限（3σ/k）約為31.3 nM（圖2e）。為驗證探針在復雜生物基質(zhì)中的適用性，開展了選擇性實驗以評估GL-Cys對多種活性物質(zhì)的響應。在通道1（λem = 830 nm）中，僅Cys引起熒光強度7.8倍的增強，而其他物質(zhì)如活性硫/氧/氮物種、氨基酸、陽離子和陰離子均未引起顯著熒光增強（圖2f）。同樣，在通道2（λem = 765 nm）中，僅Cys的加入導致熒光強度12.7倍的提升（圖2g）。這些結(jié)果表明，GL-Cys對Cys的選擇性顯著高于其他測試的生物物種，適用于生物體系中特異性的雙通道Cys識別與高保真成像。

圖3. 不同預處理條件下PANC-1細胞和4T1細胞中GL-Cys的共聚焦成像

PANC-1細胞和4T1細胞與GL-Cys共孵育，以驗證該探針有效區(qū)分不同Cys水平的能力。如圖3a、b、e和f所示，內(nèi)源性Cys觸發(fā)了細胞內(nèi)的紅色熒光發(fā)射。當PANC-1和4T1細胞在與GL-Cys孵育前，先用生物硫醇清除劑N-乙基馬來酰亞胺（NEM）預處理30 min時，紅色熒光顯著減弱，表明細胞內(nèi)Cys水平降低；相反，若細胞先用半胱氨酸供體N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）預處理30 min，再與GL-Cys孵育，則紅色熒光顯著增強，表明NAC補充有效提升了細胞內(nèi)Cys濃度。綜上，這些結(jié)果表明GL-Cys探針能夠精確檢測細胞內(nèi)Cys濃度的升高與降低。

半胱氨酸（Cys）是評估惡性腫瘤嚴重程度，尤其是胰腺癌的重要生物標志物，腫瘤鐵死亡的發(fā)生也與Cys水平密切相關。 Erastin是一種細胞滲透性鐵死亡激活劑，被廣泛認為是誘導鐵死亡的有效試劑。因此，進一步研究了GL-Cys探針在追蹤鐵死亡過程中Cys水平動態(tài)變化中的適用性。PANC-1和4T1細胞先與erastin預孵育8 h，再與GL-Cys孵育30 min，結(jié)果觀察到紅色通道熒光強度降低。Fer-1可緩解erastin誘導的胞質(zhì)和脂質(zhì)中活性氧的積累。隨后，PANC-1和4T1細胞先與erastin孵育8 h，再用Fer-1處理2 h，最后與GL-Cys孵育30 min。與僅用erastin處理的細胞相比，同時使用erastin和Fer-1處理的細胞紅色通道熒光信號略有增強（圖3c、d、g和h），表明鐵死亡細胞模型中Cys水平升高。此外，流式細胞術(shù)分析結(jié)果進一步驗證了上述發(fā)現(xiàn)（圖3i和j）。這些結(jié)果表明，GL-Cys能夠有效監(jiān)測腫瘤細胞鐵死亡過程中Cys水平的動態(tài)變化。

圖4. GL-Cys的體內(nèi)雙通道熒光成像

圖5. 乳腺癌小鼠模型中探針GL-Cys的體內(nèi)雙通道成像

受GL-Cys在胰腺腫瘤模型中優(yōu)異表現(xiàn)的啟發(fā)，研究者進一步將該探針應用于乳腺癌腫瘤模型中Cys的雙通道熒光成像。采用BALB/c裸鼠建立皮下乳腺腫瘤模型，并將小鼠分為四組（第1組：腫瘤小鼠 + GL-Cys；第2組：腫瘤小鼠 + NEM + GL-Cys；第3組：腫瘤小鼠 + erastin + GL-Cys；第4組：腫瘤小鼠 + erastin + Fer-1 + GL-Cys）（圖5a）。與第1組相比，第2組的雙通道熒光強度在0至30 min內(nèi)逐漸降低（圖5b），表明NEM誘導使4T1腫瘤內(nèi)Cys水平下調(diào)。在4T1鐵死亡誘導組（第3組）中，與第1組腫瘤小鼠相比，通道1（2.12 ± 0.03降至1.25 ± 0.02）和通道2（4.12 ± 0.03降至2.75 ± 0.02）的熒光強度均顯著下降，表明在4T1小鼠鐵死亡過程中Cys同樣被下調(diào)（圖5c和d）。在第4組中注射鐵死亡抑制劑Fer-1后，通道1和通道2的熒光信號均較第3組顯著增強（圖5c和d）。NIR比率熒光分析（通道2/通道1）亦驗證了上述結(jié)果（圖5e）。為確證鐵死亡的發(fā)生，對不同處理后的腫瘤組織進行了深入分析，并采用商業(yè)試劑盒檢測腫瘤中Cys、GSH和MDA的水平。結(jié)果顯示，Cys和GSH水平均下降，而MDA水平升高（圖5f–h），從而確證了erastin誘導的4T1腫瘤鐵死亡模型。實驗結(jié)果表明，GL-Cys可通過體內(nèi)雙通道熒光成像有效區(qū)分乳腺癌腫瘤模型與相應腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團在多重生物分析中的應用潛力。

本研究成功構(gòu)建了一類新型深NIR至NIR-II半花青熒光團（GL），其具備雙光學校準位點，可用于開發(fā)雙鎖探針。這些GL染料通過氯取代的花青/半花青雜化獲得，發(fā)射波長覆蓋800–950 nm。值得注意的是，這些染料整合了花青與半花青的光學校準位點，其光學性質(zhì)可通過中間位氯（類似花青染料）和末端氨基/羥基（類似半花青染料）輕松調(diào)控，從而顯著推動了雙鎖探針的發(fā)展?；谶@些熒光團，本文構(gòu)建了一種智能雙鎖探針GL-Cys，其在體外對Cys表現(xiàn)出優(yōu)異的響應性與選擇性，并呈現(xiàn)Cys濃度依賴性的光譜切換行為：在低Cys濃度下增強830 nm發(fā)射，在高濃度下增強765 nm信號。更重要的是，GL-Cys可通過體內(nèi)雙通道比率熒光成像，有效區(qū)分多種腫瘤模型及其相應腫瘤鐵死亡模型中的Cys水平差異，凸顯了GL熒光團作為多重生物分析通用平臺的潛力。因此，GL骨架為開發(fā)靶向多種分析物的探針提供了堅實基礎，可用于深組織中的近紅外多色成像，未來研究有望將其應用拓展至更廣泛的靶標范圍。

參考文獻

Liu Q, Li Z, Huang Y, et al. Deep-NIR to NIR-II hemicyanine fluorophore scaffolds with dual optically tunable sites for in vivo multiplexed imaging[J]. Chemical Science, 2025, 16(48): 23394-23404.