本文要點(diǎn)：具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性的供體-受體-供體（D-A-D）型小分子化合物是近紅外二區(qū)熒光成像（NIR-II FLI）引導(dǎo)腫瘤光熱治療（PTT）的理想候選材料。雖然三苯胺與四苯乙烯類似物常被用作電子供體，但其存在給電子能力有限或AIE性能欠佳等缺陷。本研究提出了一種分子設(shè)計(jì)新策略：在結(jié)構(gòu)扭曲的D-A-D框架中引入π共軛平面電子供體，成功開發(fā)出性能優(yōu)化的AIE型NIR-II探針。在合成的分子中，采用富電子TIT供體的BBT-TIT同時(shí)展現(xiàn)出高摩爾消光系數(shù)（ε = 2.352×10? M?1 cm?1）和顯著聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性（αAIE = 4.5）。值得注意的是，當(dāng)其制備成水溶性納米顆粒（BBT-TIT NPs）后，該材料不僅呈現(xiàn)明亮的NIR-II熒光（發(fā)射峰1068 nm，水中量子產(chǎn)率1.85%），還具有高效光熱轉(zhuǎn)換性能（轉(zhuǎn)換效率η=53.44%）?；铙w實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該納米顆粒能實(shí)現(xiàn)小鼠高對(duì)比度NIR-II熒光血管造影與腫瘤成像，并通過(guò)顯著的光熱效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤消融。本研究證明，將特定平面電子供體與扭曲D-A-D結(jié)構(gòu)相結(jié)合，可為開發(fā)NIR-II熒光成像引導(dǎo)光熱治療的新型AIE活性劑提供重要設(shè)計(jì)思路。

方案1. 分子設(shè)計(jì)示意圖和用于熒光光聲雙峰成像引導(dǎo)協(xié)同光療的高性能AIE型D-A-D小分子

本文提出一種將平面供體與核心受體結(jié)合的設(shè)計(jì)策略，構(gòu)建扭曲的D-A-D構(gòu)型分子。這種方法理論上可在單一分子骨架上同時(shí)優(yōu)化兩個(gè)關(guān)鍵特性：(1)通過(guò)構(gòu)象限制分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)AIE驅(qū)動(dòng)的近紅外二區(qū)發(fā)射；(2)通過(guò)增強(qiáng)光吸收和非輻射能量耗散獲得高效光熱治療效果。作為概念驗(yàn)證，設(shè)計(jì)合成了三種含平面供體的AIE型D-A-D小分子以增強(qiáng)近紅外二區(qū)熒光和光熱性能（方案1）。

方案2. BBT-IT、BBT-DID、BBT-TIT的合成路線

如方案2所示，三種不同平面電子供體（IT、DID和TIT）共價(jià)連接到電子受體BBTD上。研究發(fā)現(xiàn)這些分子（BBT-IT、BBT-DID和BBT-TIT）具有高摩爾消光系數(shù)、扭曲分子幾何構(gòu)型和顯著的AIE特性（αAIE>4.5）以及近紅外二區(qū)發(fā)射。其中含給電子TIT基團(tuán)的BBT-TIT在S0態(tài)表現(xiàn)出更大的計(jì)算二面角，具有摩爾消光系數(shù)（2.352×10? M?1 cm?1）、最亮近紅外二區(qū)熒光（量子產(chǎn)率1.85%），其納米顆粒（BBT-TIT NPs）的光熱轉(zhuǎn)換效率達(dá)53.44%。憑借這些優(yōu)勢(shì)，BBT-TIT NPs成功應(yīng)用于活體腫瘤的近紅外二區(qū)熒光成像和光熱治療。

圖1. BBT-IT、BBT-DID、BBT-TIT的理論計(jì)算

盡管許多已報(bào)道的具有D-A-D結(jié)構(gòu)的近紅外二區(qū)聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）熒光團(tuán)采用扭曲構(gòu)象（通常以TPA或TPE類似物作為電子供體來(lái)限制聚集態(tài)下的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)），但如何同時(shí)優(yōu)化這些體系的強(qiáng)AIE效應(yīng)和理想光物理特性（如吸收波長(zhǎng)、摩爾消光系數(shù)、光熱轉(zhuǎn)換效率）仍是研究熱點(diǎn)。常見問(wèn)題在于，傳統(tǒng)扭曲供體可能導(dǎo)致近紅外二區(qū)應(yīng)用的吸收特性欠佳。本研究探索了一種通過(guò)優(yōu)化π共軛電子供體來(lái)提升近紅外二區(qū)AIE熒光團(tuán)性能的策略。如方案2所示，本文將三種具有相對(duì)平面共軛結(jié)構(gòu)的電子供體——IT、DID和TIT與已知能誘導(dǎo)骨架扭曲的核心受體（BBTD）偶聯(lián)。假設(shè)這種平面供體與扭曲D-A-D框架的整合，可在保留受體核心賦予的構(gòu)象扭曲（呈現(xiàn)AIE特性）的同時(shí)，發(fā)揮供體的電子特性優(yōu)勢(shì)。通過(guò)取代反應(yīng)先將供體化合物（IT、DID、TIT）轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的錫烷中間體（IT-Sn、DID-Sn、TIT-Sn），再與受體BBTD進(jìn)行鈀催化Stille偶聯(lián)反應(yīng)，最終獲得目標(biāo)化合物（BBT-TIT、BBT-DID、BBT-IT）。

通過(guò)密度泛函理論（DFT）計(jì)算分析了BBT-IT、BBT-DID和BBT-TIT的電子結(jié)構(gòu)與分子幾何構(gòu)型。如圖1所示，三者占據(jù)分子軌道（HOMO）主要分布在整個(gè)共軛骨架上，而未占分子軌道（LUMO）則集中在缺電子受體單元上。計(jì)算得到的HOMO-LUMO能隙分別為：BBT-IT 1.26 eV、BBT-DID 1.35 eV、BBT-TIT 1.34 eV，這些較小的能隙表明其具有顯著的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）特性和近紅外二區(qū)發(fā)射潛力。其中BBT-IT的能隙最小。優(yōu)化后的S0幾何構(gòu)型顯示，三個(gè)分子均呈現(xiàn)明顯扭曲構(gòu)象：BBT核心（BBTD）與噻吩間隔基的二面角分別為BBT-IT 51.4°/52.4°、BBT-DID 56.7°/49.3°、BBT-TIT 50.1°/50.1°。這種扭曲共軛骨架有助于抑制聚集態(tài)下的強(qiáng)分子間π-π相互作用，從而提升近紅外二區(qū)熒光性能。此外，噻吩間隔基與各電子供體間的二面角分別為BBT-IT約7.3°/7.1°、BBT-DID 30.5°/26.5°、BBT-TIT 0.93°/5.5°，這些差異反映了IT、DID和TIT供體單元在連接位點(diǎn)產(chǎn)生的不同空間位阻與電子效應(yīng)，盡管它們整體保持平面核心結(jié)構(gòu)。

圖2. 光物理性質(zhì)與聚集行為研究

為評(píng)估BBT-IT、BBT-DID與BBT-TIT在*（THF）中的物理化學(xué)性質(zhì)，研究者對(duì)它們進(jìn)行了系統(tǒng)的光學(xué)表征。如圖2a所示，合成的熒光團(tuán)在有機(jī)溶劑THF中均展現(xiàn)出良好溶解性，形成均勻的綠色溶液。這些AIE型D-A-D小分子在THF中的吸收光譜顯示（圖2b）：BBT-IT、BBT-DID與BBT-TIT的主要吸收峰分別位于745 nm、731 nm和732 nm。其中，BBT-IT由于具有最小的計(jì)算HOMO-LUMO能隙（ΔE = 1.26 eV，圖1a），表現(xiàn)出紅移吸收特征。通過(guò)測(cè)定吸收波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)（?），發(fā)現(xiàn)三者數(shù)值分別為：BBT-IT 1.320×10? M?1 cm?1、BBT-DID 1.665×10? M?1 cm?1、BBT-TIT 2.353×10? M?1 cm?1。BBT-TIT顯著更高的?值表明，相較于IT和DID供體結(jié)構(gòu)，TIT供體的結(jié)構(gòu)特征特別有利于增強(qiáng)近紅外二區(qū)熒光團(tuán)的光捕獲能力。熒光發(fā)射光譜表明（圖2c）：所有三種熒光團(tuán)在THF中的發(fā)射譜帶均延伸至近紅外二區(qū)，尾端可達(dá)1500 nm。值得注意的是，在稀釋的THF溶液中，BBT-DID在發(fā)射峰（約1100 nm）附近的熒光強(qiáng)度，分別達(dá)到BBT-IT的1.5倍和BBT-TIT的2.1倍（圖2d）。這說(shuō)明在DID電子供體側(cè)鏈引入己基苯基，能有效增強(qiáng)溶解狀態(tài)下的輻射衰減途徑。

隨后通過(guò)在THF-水二元溶劑中調(diào)節(jié)水體積分?jǐn)?shù)（fw），系統(tǒng)評(píng)估了三者的AIE特性。以BBT-TIT為例（圖2e），當(dāng)fw從0%增至95%時(shí)，中心吸收峰發(fā)生約50 nm的顯著紅移，表明聚集時(shí)存在明顯的分子間相互作用。BBT-IT與BBT-DID也觀察到類似的吸收紅移。三者的近紅外二區(qū)熒光強(qiáng)度變化呈現(xiàn)出典型AIE行為：當(dāng)fw從0%增至20%時(shí)略有下降（歸因于水分子的TICT效應(yīng)）；當(dāng)水分?jǐn)?shù)繼續(xù)提升至90%時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖2f,g）。同時(shí)計(jì)算得到三者的αAIE值分別為：BBT-IT 4.2、BBT-DID 2.5、BBT-TIT 4.5。當(dāng)水分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，BBT-IT、BBT-DID與BBT-TIT的熒光成像強(qiáng)度分別增強(qiáng)3.5倍、4.2倍和5.1倍（圖2h）。這些現(xiàn)象共同證明了分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的顯著受限，從而呈現(xiàn)出典型的AIE特征。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)試證實(shí)了高水含量下納米聚集體的形成。在純THF溶液中測(cè)得的流體動(dòng)力學(xué)直徑較小：BBT-IT 6.58 nm、BBT-DID 6.97 nm、BBT-TIT 7.39 nm。與之形成鮮明對(duì)比的是，當(dāng)水分?jǐn)?shù)增至90%時(shí)，直徑分別擴(kuò)大至113.60 nm（BBT-IT）、143.35 nm（BBT-DID）和151.93 nm（BBT-TIT），證實(shí)形成了大量聚集體（圖2i）。這些結(jié)果不僅證明了三種分子顯著的AIE效應(yīng)，更凸顯了通過(guò)特定平面電子供體結(jié)構(gòu)（IT、DID和TIT）與合適受體核心的精準(zhǔn)組合，可有效調(diào)控D-A-D型近紅外二區(qū)熒光團(tuán)的分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)行為與AIE特性。

圖3. 納米顆粒的光物理性質(zhì)研究

為評(píng)估這些熒光團(tuán)在生物應(yīng)用相關(guān)的含水環(huán)境中的性質(zhì)，并進(jìn)一步研究它們?cè)诰奂癄顟B(tài)下的行為，研究者采用納米沉淀法制備了水溶性納米顆粒。通過(guò)使用兩親性共聚物DSPE-PEG2000作為基質(zhì)，分別封裝了BBT-IT、BBT-DID與BBT-TIT三種分子，最終獲得的納米顆粒分散液（分別為BBT-IT NPs、BBT-DID NPs和BBT-TIT NPs）均呈均質(zhì)狀態(tài)，外觀為綠色溶液（圖3a）。與相應(yīng)的THF溶液相比，納米顆粒的吸收光譜出現(xiàn)輕微紅移：BBT-IT NPs、BBT-DID NPs與BBT-TIT NPs的吸收峰分別位于779 nm、777 nm和778 nm（圖3b）。這些納米顆粒的近紅外二區(qū)熒光光譜均覆蓋近紅外二區(qū)窗口，發(fā)射峰位于1060 nm附近（圖3c），表明它們適用于活體近紅外二區(qū)熒光成像。通過(guò)分析相同濃度下分散液的熒光成像（圖3d），發(fā)現(xiàn)BBT-TIT NPs產(chǎn)生的圖像亮度，其信號(hào)強(qiáng)度分別約為BBT-IT NPs和BBT-DID NPs的1.6倍和1.3倍。以二氯乙烷中的IR-26（量子產(chǎn)率0.5%）作為參考標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得水相中納米顆粒的光致發(fā)光量子產(chǎn)率（QY）分別為：BBT-IT NPs 1.65%、BBT-DID NPs 1.66%、以及BBT-TIT NPs 1.85%（圖3e）。這些結(jié)果表明，在納米顆粒劑型中，BBT-TIT NPs展現(xiàn)出最明亮的近紅外二區(qū)發(fā)射和量子產(chǎn)率。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量顯示，制備的納米顆粒流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為：BBT-IT NPs 67.28 nm、BBT-DID NPs 80.14 nm和BBT-TIT NPs 75.14 nm（圖3f）。透射電子顯微鏡圖像顯示出相對(duì)均勻的球形形態(tài)，三種納米顆粒的平均直徑基本分布在60-120 nm范圍內(nèi)（圖3g-i）。此外，這些納米顆粒在PBS溶液中儲(chǔ)存15天后，尺寸未發(fā)生顯著變化，表明其具有良好的膠體穩(wěn)定性。

圖4. 納米顆粒的光熱行為研究

鑒于它們?cè)诮t外二區(qū)具有優(yōu)異的吸收特性，研究者進(jìn)一步研究了這些納米顆粒在水溶液中被915 nm激光照射時(shí)的光熱性能（圖4a）。以純水為對(duì)照，含BBT-IT NPs、BBT-DID NPs和BBT-TIT NPs（0.1 mg mL?1）的溶液在照射6分鐘后，溫度分別升高至63.8℃、58.2℃和69.0℃（圖4b）。在不同納米顆粒濃度和激光功率密度下記錄的溫度變化曲線證實(shí)了光熱效應(yīng)與濃度和功率密度之間的正相關(guān)性（圖4c,d）?；诶鋮s曲線計(jì)算得到BBT-IT NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率為63.95%，BBT-DID NPs為48.75%，BBT-TIT NPs為53.44%（圖4e）。值得注意的是，BBT-TIT NPs表現(xiàn)出出色的光熱穩(wěn)定性，在五次激光開關(guān)循環(huán)后，達(dá)到的溫度變化可忽略不計(jì)（圖4f）。本文還評(píng)估了先導(dǎo)候選材料BBT-TIT NPs用于光聲成像的潛力。它們能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的近紅外二區(qū)光聲信號(hào)，且表現(xiàn)出優(yōu)異的濃度依賴性（圖4g,h），表明其適合作為近紅外二區(qū)光聲成像的對(duì)比劑。在這三種材料中，BBT-TIT NPs展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)的性能，包括其在納米顆粒狀態(tài)下的量子產(chǎn)率、光照下的顯著升溫、良好的光熱穩(wěn)定性以及有效的光聲信號(hào)產(chǎn)生能力。這些特性使得BBT-TIT NPs成為后續(xù)活體成像與治療研究中前景的多功能制劑。

圖5. BBT-TIT NPs的體外細(xì)胞抗腫瘤治療研究

為評(píng)估BBT-TIT納米顆粒的體外抗腫瘤效果，本文采用4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。為通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞攝取情況，采用納米沉淀法將熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC）與BBT-TIT共同封裝在DSPE-PEG2000基質(zhì)中制備納米顆粒。如圖5a所示，在4小時(shí)孵育后，4T1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可觀察到與FITC相對(duì)應(yīng)的亮綠色熒光，這表明納米顆粒具有有效的內(nèi)化能力。接著通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)MTT法評(píng)估了BBT-TIT納米顆粒的細(xì)胞毒性。在沒(méi)有激光照射的情況下（圖5b），即使在100 µg mL?1濃度下，細(xì)胞存活率仍保持較高水平（≈96%）。該結(jié)果表明納米顆粒本身具有良好的生物相容性。然而當(dāng)使用915 nm激光（1.0 W cm?2，持續(xù)6分鐘）照射時(shí)，觀察到顯著的劑量依賴性光毒性：細(xì)胞存活率隨納米顆粒濃度增加而急劇下降，在100 µg mL?1時(shí)降至約9.1%（圖5b），證明了BBT-TIT納米顆粒在體外具有強(qiáng)效的光熱治療作用。

使用鈣黃綠素AM（將活細(xì)胞染成綠色）和碘化丙啶（PI，將死細(xì)胞染成紅色）進(jìn)一步觀察光熱殺傷效果。如圖5c所示，對(duì)照組細(xì)胞（未處理）、單獨(dú)激光照射的細(xì)胞，以及僅用BBT-TIT納米顆粒孵育但未照射的細(xì)胞都顯示出主要為綠色熒光，證實(shí)了所用激光功率及納米顆粒本身的低毒性。與此形成鮮明對(duì)比的是，經(jīng)BBT-TIT納米顆粒（100 µg mL?1）孵育并隨后暴露于915 nm激光照射的4T1細(xì)胞呈現(xiàn)出大范圍的紅色熒光，表明光熱治療導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞死亡。經(jīng)BBT-TIT納米顆粒加激光處理的組別顯示出凋亡和壞死細(xì)胞比例，達(dá)到約90%（圖5d）。這些綜合的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力表明BBT-TIT納米顆粒在活體中具有實(shí)現(xiàn)有效光熱治療的潛力。

圖6. BBT-TIT NPs的體內(nèi)抗腫瘤治療研究

就體內(nèi)近紅外二區(qū)熒光及光聲成像而言，將BBT-TIT納米顆粒（濃度830 µm，體積150 µL）經(jīng)靜脈注射入荷4T1腫瘤的小鼠體內(nèi)。注射前，腫瘤區(qū)域和血管中的基線近紅外二區(qū)熒光和光聲信號(hào)均極微弱（圖6a-d）。注射后，在近紅外二區(qū)熒光圖像中于注射后6分鐘就觀察到腹部和后肢血管的清晰顯影（圖6e,g），計(jì)算得到的信背比分別為18.09和14.36（圖6f,h），證實(shí)了BBT-TIT納米顆粒在高對(duì)比度血管成像中的應(yīng)用價(jià)值。注射后6小時(shí)腫瘤區(qū)域開始出現(xiàn)明顯的近紅外二區(qū)熒光信號(hào)，并逐漸增強(qiáng)，在注射后12小時(shí)達(dá)到峰值（圖6a,b），這表明BBT-TIT納米顆粒通過(guò)增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)）在腫瘤內(nèi)實(shí)現(xiàn)了有效的富集。注射24小時(shí)后腫瘤熒光信號(hào)逐漸減弱，推測(cè)是納米顆粒代謝清除所致。同樣地，腫瘤組織中的光聲信號(hào)也持續(xù)增加，在注射后12小時(shí)達(dá)到（圖6c,d）。

圖7. BBT-TIT NPs體內(nèi)光熱治療研究