本文要點：近紅外 I/II 熒光蛋白 （NIR-I/II FPs） 對于體內(nèi)成像至關(guān)重要，但目前的 NIR-I/II FP 面臨著包括稀缺性、發(fā)色團成熟要求和發(fā)射波長有限（通常< 800 nm）等挑戰(zhàn)。在這里，我們利用合成蛋白質(zhì)尋求的 NIR-II 染料作為發(fā)色團，通過位點特異性親核取代反應與標簽蛋白（例如人血清白蛋白、HSA）共價結(jié)合，從而創(chuàng)建概念驗證仿生 NIR-II FP。這種化學蛋白尋找策略可以在溫和的生理條件下完成，無需催化。蛋白質(zhì)組學分析可識別特異性結(jié)合位點（DIII上的Cys 477）。NIR-II FP顯著增強了發(fā)色團的亮度和光穩(wěn)定性，同時提高了生物相容性，從而實現(xiàn)了高性能的NIR-II淋巴造影和血管造影。該策略具有通用性，適用于創(chuàng)建各種光譜分離的NIR-I/II FP，用于實時可視化多個生物事件?？傮w而言，這種簡單的仿生方法有可能改變基于熒光蛋白的生物成像，并使原位白蛋白靶向能夠產(chǎn)生用于活生物體深層組織成像的NIR-I/II FP。

小動物活體成像系統(tǒng)

圖2. 使用HSA@CO-1080 FP的高性能NIR-II淋巴造影和血管造影

本文研究了 HSA@CO-1080 FP 進行 NIR-II 淋巴造影的能力。HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激發(fā)下表現(xiàn)出淋巴結(jié)定位和淋巴管劃定，優(yōu)于游離CO-1080發(fā)色團。值得注意的是，HSA@CO-1080 FPs在>1500 nm成像窗口保持了出色的淋巴成像能力， 與臨床ICG相比，HSA@CO-1080 FPs也顯示出顯著NIR-II淋巴成像能力和更長的時間窗口。NIR-II FPs隨后成功應用于圖像引導的淋巴結(jié)精確解剖和淋巴水腫疾病的高質(zhì)量可視化（圖2b，c）?？偠灾琀SA@CO-1080 FP 是下一代 NIR-II 淋巴造影的主要候選者，解決了臨床ICG 淋巴造影的缺陷/局限性。

血管對于輸送營養(yǎng)和維持全身器官的正常功能至關(guān)重要。高質(zhì)量的血管造影可以幫助外科醫(yī)生更有效地識別各種器官的血管病變并評估術(shù)后血流恢復情況。因此，我們對HSA@CO-1080 FP進行了一系列臨床前血管造影研究。如圖所示。2d–f、HSA@CO-1080 FP 與 CO-1080 發(fā)色團相比，表現(xiàn)出全身和局部（腿部）血管 NIR-II 成像能力。將成像窗口切換到更長的波長，進一步提高了成像質(zhì)量，特別是在>1400 nm和 > 1500 nm 成像窗口中，幾乎沒有皮膚/背景信號干擾。此外，1064 nm 激發(fā)實現(xiàn)了更突出的組織穿透深度和空間分辨率，進一步突出了 HSA@CO-1080 FP 優(yōu)于 CO-1080 染料的優(yōu)勢。正如預期的那樣，HSA@CO-1080 FPs可以實現(xiàn)對血管的多/長期監(jiān)測，不受任何皮膚信號的明顯干擾，這也充分證實了HSA@CO-1080 FPs長期檢測/追蹤血管相關(guān)疾病的能力。

由于血管夾層的多樣性和穿支皮瓣設(shè)計的復雜性，術(shù)后灌注下常導致缺血缺氧引起的局部壞死，使皮瓣壞死成為皮瓣手術(shù)和最嚴重的并發(fā)癥。不幸的是，目前還沒有合適的成像技術(shù)來準確和監(jiān)測皮瓣功能。HSA@CO-1080 FP 成功地在術(shù)后對改良的穿支皮瓣模型進行了高對比度的實時監(jiān)測，以模擬臨床皮瓣移植。與正常大鼠不同，HSA@CO-1080 FPs能夠清晰地顯示皮瓣模型的術(shù)后恢復情況，并準確定位缺血性壞死區(qū)域（圖2g）.靜脈注射HSA@CO-1080 FPs，仔細觀察皮瓣區(qū)域的血路，發(fā)現(xiàn)兩條預留的臀下動脈（IGA）穿支血管先亮起，然后逐漸向上擴散。與建模前的成像結(jié)果相比，皮瓣模型組觀察到阻塞血管的打開和血運重建（圖2h）。由于背景信號低和排泄快（能夠重復觀察），HSA@CO-1080 FP成功地可視化了整個皮瓣模型的進展。NIR-II成像證實，進展大致可分為三個階段：術(shù)后第2天，遠端皮瓣出現(xiàn)明顯腫脹，轉(zhuǎn)為深紫色，并開始出現(xiàn)缺血性壞死。術(shù)后第4天，遠端皮瓣壞死區(qū)加重，呈深褐色。術(shù)后第7天，遠端皮瓣出現(xiàn)黑色結(jié)痂，伴有干性壞死，與近端有明顯的分界。 HSA@CO-1080 FPs共同具有優(yōu)異的NIR-II血管造影能力，可促進NIR-II熒光成像技術(shù)的早期臨床轉(zhuǎn)化，并提供一種有效的監(jiān)測皮瓣功能的方法。

實時多通道NIR-I/II成像系統(tǒng)可同時記錄多個事件，可洞察疾病發(fā)生機制，提高成像效率，具有較高的體內(nèi)和臨床適用性。多種生物事件的集成熒光成像依賴于非串擾熒光探針。本文構(gòu)建了仿生NIR-I FP（HSA@IR-808和β-LG@IR-780），并將它們與NIR-II FP（HSA@CO-1080和DIII@CO-1080）相結(jié)合（圖3a）。合成的NIR-I和NIR-II FP分別在808 nm和1064 nm激發(fā)下實現(xiàn)了非重疊發(fā)射，提供了優(yōu)異的雙色成像潛力（圖3b–d）。隨后，使用NIR-I和NIR-II FP進行了一系列體內(nèi)多通道生物成像實驗。首先，使用HSA@IR-808 FP和HSA@CO-1080 FPs成功實現(xiàn)了集成的多通道NIR-II淋巴成像（圖3e-g）. 這些NIR-I/II FPs成功地實現(xiàn)了腫瘤浸潤前哨淋巴結(jié)的精確共定位，從而指導術(shù)中有效的手術(shù)切除（避免不必要的切除）（圖3f，g）。使用 HSA@IR-808 FP 和 HSA@CO-1080 FP 也實現(xiàn)了無串擾的血管和淋巴系統(tǒng)的集成 NIR-II 生物成像（圖3h），這對于精確的成像引導手術(shù)很重要。HSA@CO-1080 FPs（肝膽排泄）和 β-LG@IR-780 FPs（腎排泄）的組合可以同時可視化兩種藥代動力學途徑，而不會出現(xiàn)串擾問題。綜上所述，基于仿生策略構(gòu)建的NIR-I/II熒光蛋白具有出色的多色生物成像應用潛力，有望實現(xiàn)多種生物事件的綜合實時成像，更好地輔助臨床醫(yī)生處理復雜疾病。

圖3. 用于多色活體成像的仿生NIR-I/II FP

參考文獻

Xu, J., Zhu, N., Du, Y. et al. Biomimetic NIR-II fluorescent proteins created from chemogenic protein-seeking dyes for multicolor deep-tissue bioimaging. Nat Commun 15, 2845 (2024).