近年來，基于親和配體或質(zhì)譜技術(shù)（MS）的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，在診斷或預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中起到越來越大作用，特別是質(zhì)譜血漿蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域取得了尤為顯著的進步，但這些生物標(biāo)志物的臨床驗證和應(yīng)用仍受限于依賴過時的三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)。因此，一種新型的質(zhì)譜方法技術(shù)應(yīng)運而生，大大提高了生物標(biāo)志物的驗證和轉(zhuǎn)化效率。

2025年8月13日，Molecular & Cellular Proteomics （MCP）雜志在線發(fā)表了丹麥哥本哈根大學(xué)Matthias Mann 教授組與Thermo Fisher Scientific色譜質(zhì)譜部團隊題為“A novel hybrid high speed mass spectrometer allows rapid translation from biomarker candidates to targeted clinical tests using 15N labeled proteins”的論文。

研究評估了一種新型的高通量混合質(zhì)譜儀——Thermo Scientific™ Stellar™質(zhì)譜儀（Stellar MS），在血漿蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的工作流程，使用短梯度即可快速定量分析數(shù)千條目標(biāo)肽段，覆蓋超過1000種血漿蛋白。它將三重四極桿的穩(wěn)健性與強大的線性離子阱質(zhì)量分析器相結(jié)合，能夠進行極快速且靈敏的平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）和MS3多級掃描模式。Stellar MS可針對原本在Orbitrap Astral MS上測量的數(shù)千種肽段進行靶向分析，具備高靈敏度、高特異性、重現(xiàn)性好等特點。此外，絕對定量通常是臨床檢測的要求，因此研究團隊利用15N 標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，還開發(fā)了一套快速、簡單易用的針對酒精相關(guān)肝?。ˋLD）生物標(biāo)志物的定量方法，展示了 Stellar MS 在臨床應(yīng)用中的潛力。最終研究結(jié)果表明，Stellar MS 能夠無縫銜接蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定與常規(guī)的臨床檢測，從而有助于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在診斷和預(yù)后的應(yīng)用。

文章重點

● Stellar MS血漿蛋白生物標(biāo)志物分析流程的介紹

● 從DIA數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果到PRM目標(biāo)方法的建立

● 數(shù)以千計條目標(biāo)肽段的高通量分析

● 血漿中15N重標(biāo)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的評價

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在本研究之前，三重四極桿質(zhì)譜儀以其結(jié)構(gòu)簡單卻效果顯著而聞名，仍是蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物靶向檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。它靈敏度高和穩(wěn)定性好，對于可靠的臨床診斷至關(guān)重要，并且易于與同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品配合使用以實現(xiàn)絕對定量。然而，掃描模式僅限于使用選擇或多重反應(yīng)監(jiān)測（SRM/MRM），而非采集整張 MS/MS譜圖。這一局限性在一定程度上，阻礙了蛋白質(zhì)組學(xué)從發(fā)現(xiàn)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，而且方法開發(fā)必須依賴標(biāo)準(zhǔn)品，通量上也滿足不了大規(guī)模肽段進行同時定性定量的需求，即便實現(xiàn)了足夠的特異性和靈敏度，整個分析過程通常也需要數(shù)月之久。

因此，本研究探索了一種全新的工作流程，以開始解決上述挑戰(zhàn)。Stellar MS旨在將三重四極桿的易用性與先進的雙壓線性離子阱質(zhì)量分析器的優(yōu)點融為一體。與三重四極桿的最后一個四極桿相比，線性離子阱捕獲了肽段離子的所有碎片，然后快速獲得碎片離子的質(zhì)譜圖。這個過程其實我們已經(jīng)非常熟悉，而且臨床上已經(jīng)被廣泛接受，不同的是規(guī)模大大增加了，并具有平行碎片積累和全掃描質(zhì)量分析，同時實現(xiàn)定量和定性的優(yōu)勢，這有望實現(xiàn)前所未有的靈敏度、特異性和速度，包括平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）和MS3多級掃描能力。

此外，Stellar MS可方便結(jié)合15N全長重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的使用，快速建立可靠的定量體系。與基于肽段的同位素標(biāo)記不同，這種標(biāo)準(zhǔn)品減少了酶切和樣品制備過程帶來的波動性，可提高定量準(zhǔn)確度。15N標(biāo)記還減少了MS2質(zhì)譜圖的潛在干擾，提高了碎片離子的定量可靠性。這種方法有望檢測出蛋白質(zhì)的不同形式和翻譯后修飾類型，增強蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷潛力。

最后，研究團隊還利用Stellar MS方法中自適應(yīng)實時保留時間校正功能（Adaptive RT），以一個很窄的保留時間窗口（RT window），將從Orbitrap Astral MS鑒定到的全部血漿肽段轉(zhuǎn)移到PRM方法中，并描述了如何優(yōu)先選擇最特異性的肽段進行最終的靶標(biāo)分析。本研究最后獲得了一組15N標(biāo)記的肝病蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，有望推進臨床上肝病通用檢測的前景。

樣本信息：病人血漿

前處理：Neat plasma，spike-in 15N標(biāo)記蛋白，Trypsin酶切

上樣量：500 ng或250 ng酶切肽段

Orbitrap Astral MS方法

納升液相：Evosep One liquid chromatography (LC) system (Evosep Biosystems) 

色譜柱：8 cm IonOptics Aurora Rapid column (8cm, 150 μm ID, 1.7 μm C18)，60SPD，柱溫50°C

質(zhì)譜儀：Orbitrap Astral mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific)

離子源：Easy-spray with FAIMS Pro  (Thermo Fisher Scientific)  

采集模式：DIA

Stellar方法

在Stellar MS上使用了gas-phase-fractionation  DIA （GPF DIA）進行蛋白鑒定，跟Orbitrap Astral MS的結(jié)果可進行對比，另外，分別建立PRM Targeted MS2/MS3 LC-MS方法進行靶標(biāo)蛋白分析。

納升液相：Evosep One liquid chromatography (LC) system (Evosep Biosystems) 

色譜柱：8 cm ionOptics Aurora Rapid column (8cm, 150 μm ID, 1.7 μm C18)，60SPD，柱溫50°C

質(zhì)譜儀：Stellar MS (Thermo Fisher Scientific)

離子源：Easy-spray with FAIMS Pro (Thermo Fisher Scientific) 

采集模式：GPF DIA （6個），Adaptive RT DIA

采集模式：tMS2，Adaptive RT DIA

采集模式：tMS3，Adaptive RT DIA

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使用Skyline和PRM conductor進行靶標(biāo)母離子的選擇

PRM方法相對于SRM/MRM方法的一大優(yōu)勢就是方法建立更加簡單快捷，只需要有母離子列表就可以建立儀器采集方法，進行樣品數(shù)據(jù)的采集，而不需要先獲得標(biāo)準(zhǔn)品進行離子對的參數(shù)優(yōu)化。目前，我們可以通過三種方式創(chuàng)建Stellar MS的靶標(biāo)肽段分析方法（如下圖所示），本研究中，主要是評價了前兩種方式，即基于 Orbitrap Astral MS或Stellar MS的肽段鑒定結(jié)果，篩選出母離子列表，從而建立PRM方法。

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在這個過程中，研究人員使用了Skyline軟件及其外置工具PRM conductor （Thermo Fisher Scientific, Inc.開發(fā)）來完成，只需要四步就可以輕松將不同搜索引擎獲得的鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)化成PRM母離子列表（如圖所示）。

步驟一：Orbitrap Astral MS DIA數(shù)據(jù)分析?？墒褂肞roteome Discoverer/Chimerys、DIA-NN或Spectronaut軟件進行檢索，本研究中主要使用了DIA-NN 1.9.1進行DIA數(shù)據(jù)的分析，另外Stellar MS采集的GPF DIA數(shù)據(jù)，通過Proteome Discoverer/Chimerys進行數(shù)據(jù)檢索。

步驟二：Skyline 譜庫的建立。將檢索結(jié)果文件導(dǎo)入Skyline進行建庫，然后導(dǎo)入DIA原始數(shù)據(jù)進行提峰。

步驟三：tMS2/tMS3母離子列表的創(chuàng)建。使用PRM conductor進行靶標(biāo)肽段的過濾，設(shè)置靶標(biāo)分析方法參數(shù)，最后軟件自動導(dǎo)出PRM母離子列表（并生成Adaptive RT reference *.rtbin文件，用于保留時間實時校準(zhǔn)），建立PRM儀器方法。

步驟四：Stellar tMS2/MS3數(shù)據(jù)采集和分析。結(jié)合Adaptive RT采集PRM數(shù)據(jù)，可使肽段采集窗口更準(zhǔn)確，然后導(dǎo)入PRM數(shù)據(jù)到Skyline，再次使用PRM conductor進行過濾，并創(chuàng)建新的PRM方法用于最終的樣品分析。

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結(jié)果展示

此前，通常使用三重四極桿質(zhì)譜儀進行靶標(biāo)分析。從概念上講，其布局很簡單，首先在第一個四極桿中選擇母離子，然后在第二個四極桿中進行碰撞碎裂，在第三個四極桿中選擇子離子（離子對）（如論文圖 1A）。由于一次只能檢測一個子離子，因此在給定時間可測量的離子對數(shù)量有限。獲取完整的 MS/MS 全譜效率極低，從而影響定性能力或降低通量。因此，在靶向 MS 檢測中，通常只監(jiān)測最強且特異最高的子離子，每個肽段為三到五個。

如今，本研究使用了這款新型的高通量混合質(zhì)譜儀 Stellar MS 采用了類似的設(shè)計原則，但其第三個質(zhì)量分析器并非四極桿，而是采用了雙壓線性離子阱（LIT）（如論文圖 1 B），單位質(zhì)量分辨率下，質(zhì)量分析掃描速率可達 125 kDa/s，是一些高端三重四極桿質(zhì)譜儀的6倍或以上，tMS2和tMS3掃描速度分別為140Hz和40Hz，另外具備離子阱質(zhì)量分析器獨特的MSn多級掃描，可高達MS10。硬件上還沿用了OT Astral MS的光電倍增器（PMT），兩邊是一對高能轉(zhuǎn)換打拿極，能帶來優(yōu)異的檢測靈敏度和穩(wěn)定性，以及超長的使用壽命。

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亮點1：

Stellar MS同時具備優(yōu)異的定性和定量能力，可實現(xiàn)DDA/DIA/PRM等掃描模式，所以在靶向蛋白分析方法的開發(fā)中，研究人員也評價了從Stellar鑒定結(jié)果到PRM方法的流程，結(jié)果表明，使用GPF DIA可實現(xiàn)很好的鑒定結(jié)果，并通過PRM conductor可篩選出質(zhì)量很高的肽段母離子用于靶標(biāo)分析。（如論文圖2A所示）

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結(jié)果表明，兩種檢測方法的定量重復(fù)性都較為相似，基于Stellar MS的檢測方法中，接近 85% 的肽段變異系數(shù)低于 20%，而基于OT Astral MS的檢測方法中，75% 肽段變異系數(shù)低于 20%（如論文圖4C）。另外，兩種流程獲得基本一致的鑒定準(zhǔn)確率（如論文圖4e、f）。

亮點2：

新型的 Stellar MS在靶向蛋白檢測中表現(xiàn)出了優(yōu)異的靈敏度和重現(xiàn)性。研究團隊對血漿標(biāo)志物進行了驗證，結(jié)果顯示，所有用于絕對定量的肽段，歸一化到重標(biāo)肽信號后，實現(xiàn)了平均 CV 為 5.1%，100% 的定量肽段 （橙色）CV 低于 20%（如論文補充圖 6所示），對比沒有內(nèi)標(biāo)時的波動，顯著提升了定量的穩(wěn)定性。

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亮點3：

檢測限（LOD）和定量限（LOQ）符合預(yù)期，大多數(shù)肽段 LOD 和 LOQ 低于 0.1 ng ，部分甚至達到amol級別的靈敏度（如論文補充圖 7所示）。 

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這種性能使得研究人員能夠在短梯度分析中同時追蹤數(shù)百個肽段。以酒精相關(guān)性肝?。ˋLD）的血漿蛋白為例，本研究完整地演示了如何從 DIA 發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)遷移到臨床可用的 PRM/MS3 靶向檢測方法，使得部分目標(biāo)肽獲得更好的信噪比（如論文補充圖7所示）和LOD/LOQ，但值得一提的是不同肽的這種效果有所不同。

亮點4：

在這一過程中，15N重蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用。作為“全長蛋白內(nèi)標(biāo)”，它們與內(nèi)源蛋白經(jīng)歷完全相同的變性、還原和消化步驟，能夠真實反映實驗全過程，從而提供高度一致的定量參考，且輕（橙色）與重（藍色）肽段在蛋白序列上的強度軌跡基本保持一致。（如論文補充圖9所示）

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總結(jié)：

通過這種方式，研究團隊建立了一個既可擴展、又可遷移的質(zhì)譜檢測流程，從基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)研究到臨床級檢測實現(xiàn)了高效的無縫銜接。這一成果不僅驗證了 Stellar MS 的潛力，更突出了高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)中的決定性作用。

Mann教授組作為國際質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的團隊，研究成果對整個領(lǐng)域具有示范意義。我們很榮幸能和他們合作評價這臺創(chuàng)新的Stellar MS以及靶標(biāo)蛋白分析流程。Stellar MS 具備優(yōu)異的靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、易用性等多個優(yōu)勢，大量的單蛋白生物標(biāo)志物檢測方法有可能被取代，更傾向于采用一次進樣中同時分析多個蛋白質(zhì)，定量濃度可從幾百ug/mL甚至到pg/mL，并能覆蓋許多在常規(guī)臨床中使用的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

最后值得再次強調(diào)的是，Stellar MS具備很多三重四極桿質(zhì)譜沒有的MS3采集方式，而且是行之有效、實用的，本研究結(jié)果表明，基于 MS3 的采集模式的確能夠進一步降低LOD，雖然這并不適用于實驗中所有的肽段離子（尤其是那些長度低于10個氨基酸的肽段），但對于較長的肽段，通常能有效地將LOD減半。因此，將 MS2 和 MS3 檢測方法結(jié)合起來，針對每個肽段選擇相應(yīng)的采集方案，這樣很可能會生成具有最佳靈敏度和特異性的靶向檢測方法，這恰恰也是Stellar MS方法設(shè)置靈敏性的又一體現(xiàn)。

生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用的道路任重而道遠，Stellar MS的橫空出世，展示出巨大的前景，可謂給廣大科研人員提供一個更強有力的平臺，加速研究成果的落地。

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原文：

A novel hybrid high speed mass spectrometer allows rapid translation from biomarker candidates to targeted clinical tests using 15N labeled proteins - ScienceDirect

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