流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟

A. 染色緩沖液

• 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) + 1% BSA： Na2HPO4•12H2O 3.63 g，KH2PO4 0.24g ，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，BSA 10 g，加純水定容至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 7.2-7.4

B. 準(zhǔn)備細(xì)胞

1. 將收集好的細(xì)胞重懸于 5 mL 4℃預(yù)冷的染色緩沖液中，800-1400 rpm 離心 5min；

2. 棄上清，5 mL 4℃預(yù)冷的染色緩沖液重懸細(xì)胞，800-1400 rpm 離心 5min；

3. 固定和透化（選做步驟）。用細(xì)胞處理試劑盒處理細(xì)胞（BD Pharmingen™ ，貨號(hào)：554714）4. 棄上清，4℃預(yù)冷的染色緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度至 2×107 個(gè)/mL。

C. 免疫染色

1. 將 50 μL 細(xì)胞懸液（106 個(gè)）轉(zhuǎn)移至流式管；

2. 加入適量特異性抗體，4℃避光孵育 20min；

3. 每管加入 3mL 染色緩沖液清洗細(xì)胞 2 次，800-1400rpm 離心 5min；

4. 棄上清，輕渦旋混勻細(xì)胞；

5. 若特異性抗體為非標(biāo)記抗體，于細(xì)胞懸液中加入適量的二抗，重復(fù)步驟 2-3；

6. 每管中加 200 μL 染色緩沖液重懸細(xì)胞，400 目濾網(wǎng)過(guò)濾至新的流式管中，當(dāng)日上機(jī)檢測(cè)。

D. 備注

1. 請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)確定離心轉(zhuǎn)速；

2. 可通過(guò)抗體滴定來(lái)優(yōu)化抗體使用量；

3. 請(qǐng)根據(jù)一抗類型選擇合適的二抗。

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