RNA 干擾（RNAi）是有效敲低基因表達(dá)以研究各種細(xì)胞類型中蛋白功能的最佳方法。在哺乳動物細(xì)胞的基因敲低過程中，傳統(tǒng)的 RNAi 方法需要使用合成的 RNA 二聚體（含有兩條未經(jīng)修飾的 21 聚體寡核苷酸），經(jīng)退火形成的短小干擾 RNA (siRNA)。Invitrogen™ Ambion™?Silencer™ Select siRNA?和?Stealth RNAi™ siRNA?利用化學(xué)修飾技術(shù)改進(jìn)了上述傳統(tǒng)二聚體，以確保更好的 RNAi?結(jié)果。 

賽默飛提供siRNA產(chǎn)品，請?jiān)L問獲取產(chǎn)品信息。 

Silencer siRNA 

預(yù)設(shè)計(jì)的 Invitrogen?Silencer siRNA 適用于 RefSeq 數(shù)據(jù)庫中所有人類、小鼠和大鼠基因靶標(biāo)。這些 siRNA 是利用高效且經(jīng)廣泛測試的算法設(shè)計(jì)得到，專門用于實(shí)現(xiàn)效力和特異性的基因沉默。每種 siRNA 均按照最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合成并且提供完整的序列信息。 

此外，當(dāng)您購買針對相同靶點(diǎn)的三種 Silencer 預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 時(shí)，我們保證至少兩個(gè) siRNA 會將靶標(biāo) mRNA 水平降低 >70%。 

優(yōu)化設(shè)計(jì) = 保證沉默 

Silencer 預(yù)設(shè)計(jì)和驗(yàn)證 siRNA 通過專有算法設(shè)計(jì)，專門用于實(shí)現(xiàn)效力和特異性。在近400種內(nèi)源表達(dá)的人轉(zhuǎn)錄本沉默實(shí)驗(yàn)中，我們測得約1,100種經(jīng)該算法設(shè)計(jì)的 siRNA的效率。此研究表明，對于每個(gè) siRNA，超過 80% 的 siRNA 個(gè)體表現(xiàn)出 >>70% 的靶標(biāo)沉默效果。性能數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)了 Ambion siRNA 選擇過程的成功。 

Silencer 預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 的有效性。此圖顯示了針對靶向 >300 種內(nèi)源表達(dá)的人基因的808種 Silencer 預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 測得的基因沉默效果分布情況。靶標(biāo) mRNA 水平在轉(zhuǎn)染成 HeLa 細(xì)胞后48小時(shí)通過 qRT-PCR 測定。超過 82% 的 siRNA 均成功沉默 >70% 的靶標(biāo)。 

經(jīng)驗(yàn)證的 Silencer siRNA 

針對人靶標(biāo)的一組 Silencer siRNA 系列已經(jīng)通過內(nèi)部的功能測試，經(jīng)驗(yàn)證，可以將靶標(biāo) mRNA 水平至少減少 70%，使我們能夠保證這些 Silencer 經(jīng)驗(yàn)證 siRNA 能夠敲低其靶標(biāo)基因。這些 siRNA 的數(shù)據(jù)表展示了在測試期間觀察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外顯子。對于大多數(shù)類型，還免費(fèi)提供完整的序列信息。 

我們在先進(jìn)機(jī)構(gòu)中合成和純化各 siRNA 以便滿足最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。作為我們嚴(yán)格的質(zhì)量控制程序的一部分，每個(gè) RNA 寡核苷酸均由 MALDI-TOF 質(zhì)譜和/或分析型 HPLC 分析。為了提供質(zhì)量，Ambion 還通過凝膠電泳評估每個(gè)退火的 siRNA，以確認(rèn)該鏈正確退火。因此是被純化并可以直接使用的優(yōu)質(zhì) siRNA 。 

Stealth RNAi siRNA 

Invitrogen Stealth RNAi siRNA 采用下一代 RNAi 化學(xué)成分，其特異性以及血清和細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定性均高于標(biāo)準(zhǔn) siRNA。這種化學(xué)成分在消除不必要的脫靶效應(yīng)的同時(shí)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)： 

· 有效敲低 

· 更高特異性 

· 更好穩(wěn)定性 

· 更低細(xì)胞毒性 

Stealth RNAi siRNA 采用極嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制造。每個(gè)單鏈 RNA 寡核苷酸均通過質(zhì)譜分析，然后退火并提供指定數(shù)量的雙鏈。 

Stealth siRNA 下一代化學(xué)成分的優(yōu)點(diǎn) 

有效敲低 

Stealth RNAi siRNA 提供有效敲低效率，以確保靶標(biāo)基因的沉默。圖1顯示了 Stealth RNAi 和未修飾 siRNA 之間的沉默比較，Stealth RNAi 具有以下功能保證：倘若您實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效率至少為 80%，對于每種基因，3種試劑中的至少2種將使夠?qū)崿F(xiàn)至少 70% 的轉(zhuǎn)錄物敲低。 

圖1.使用 Invitrogen Lipofectamine 2000 遞送的 siRNA 和 Stealth RNAi siRNA 可減少 A549 細(xì)胞中 p53 的表達(dá)。相應(yīng)的對照包括化學(xué)成分匹配且堿基對成分類似的隨機(jī)序列。p53 表達(dá)的減少表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)化為 GAPDH 的 p53 的表達(dá)倍數(shù)變化（相對于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 測量的相應(yīng)對照品）。 

更高的特異性 

當(dāng) siRNA 與非靶向基因足夠同源時(shí)，會發(fā)生脫靶效應(yīng)，從而使其與預(yù)期靶標(biāo)沉默。Stealth RNAi 可以消除使用傳統(tǒng) siRNA（即使是低濃度）導(dǎo)致的可能存在問題的正義鏈介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。這些問題可能是由于未修飾 siRNA 的正義和反義鏈都能進(jìn)入 RNAi 通路所引起。但 Stealth RNAi 修飾只允許反義鏈有效進(jìn)入 RNAi 通路。這種修飾消除了對正義鏈脫靶效應(yīng)的擔(dān)憂。 

圖2.?Stealth RNAi siRNA 表現(xiàn)出更高的靶標(biāo)特異性。 

更好的穩(wěn)定性 

與傳統(tǒng)、未修飾的 siRNA 相比，Stealth RNAi 修飾還能提高穩(wěn)定性。傳統(tǒng) siRNA 在含核酸酶的血清中隨時(shí)間降解，因而它們不適合用于動物。 

但是，Stealth RNAi siRNA 可穩(wěn)定長達(dá)72小時(shí)（圖3），因而成為涉及使用動物模型的項(xiàng)目的更好選擇。這種靈活性可以節(jié)省數(shù)周時(shí)間，免卻了為動物研究和細(xì)胞培養(yǎng)工作開發(fā)和測試不同分子的需要。 

圖 3.?Stealth RNAi siRNA 在血清中比標(biāo)準(zhǔn) siRNA 更穩(wěn)定。在 10% 小鼠血清中孵育后0、4、8、24、48、72小時(shí)的未修飾 21-mer dsRNA 序列（左圖）和相應(yīng)的 Stealth RNAi siRNA 序列（右圖）。孵育樣品后，在 Invitrogen Novex 15% TBE-尿素聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠上分離。 

更低細(xì)胞毒性 

使用標(biāo)準(zhǔn) siRNA 的研究表明，未修飾 siRNA 可以誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)通路，如可導(dǎo)致生長抑制和細(xì)胞毒性的干擾素反應(yīng)。這使得很難評估觀察到的細(xì)胞表型是非特異性應(yīng)激反應(yīng)還是靶向基因的功能喪失所導(dǎo)致。Stealth RNAi 消除了 PKR/干擾素反應(yīng)通路的誘導(dǎo)發(fā)生，確保 RNAi 實(shí)驗(yàn)結(jié)果更清晰（圖4）。使用 Stealth RNAi 可實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的基因敲低而無激活細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致結(jié)果難以解釋。 

圖4.?Stealth RNAi siRNA 避免干擾素反應(yīng)基因的誘導(dǎo)。在送入 A549 細(xì)胞后，siRNA 序列誘導(dǎo)多種干擾素基因。siRNA 序列相同的 Stealth RNAi siRNA 型號不會改變干擾素反應(yīng)基因的表達(dá)。 

處理和重懸 

siRNA 試劑的儲存和穩(wěn)定性： 

在 –20°C 以干燥顆粒形式儲存，直至使用。一旦重懸，請?jiān)?–20°C 下儲存并避免與 RNase 接觸。在 -20°C 下儲存至少一年。 

重懸 siRNA 

根據(jù)圖表在 DEPC 處理過的水中重懸 siRNA 或 Stealth RNAi 雙鏈，以制備 20 µM 溶液。將緩沖溶液脫水制備 RNA 寡核苷酸。重懸至 20 µM 會將緩沖液復(fù)溶為 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、20 mM NaCl 和 1 mM EDTA。 

Stealth RNAi 和 siRNA 轉(zhuǎn)染濃度 

Stealth RNAi siRNA 或 siRNA 雙鏈的轉(zhuǎn)染濃度通過將所用摩爾量除以取決于最終轉(zhuǎn)染體積（即起始培養(yǎng)基體積加轉(zhuǎn)染混合物體積）確定。使用強(qiáng)效 siRNA 時(shí)，我們通常通過針對24孔板中的每個(gè)孔向 500 µL 培養(yǎng)基（最終濃度 0.8 - 8 nM）中加入 100 µL 轉(zhuǎn)染混合物來轉(zhuǎn)染 0.5 – 5 pmol。要按比例放大，請?jiān)黾?siRNA 數(shù)量使其濃度不變。我們建議使用能夠敲低您基因的 siRNA 量，以避免任何非特異性或脫靶效應(yīng)。 

Silencer Select siRNA 

· 集成了最新改良的siRNA設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)預(yù)測算法和化學(xué)修飾方法 

· 具有沉默一致性、效力和特異性 

· 由于沉默效果不佳而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗結(jié)果的次數(shù)大大減少 

· 生成更為清晰和穩(wěn)定的表型數(shù)據(jù) 

· 升級：siRNA實(shí)驗(yàn)假陽性和假陰性結(jié)果大大減少 

Silencer Select siRNAs具有以下四大優(yōu)勢： 

· 高沉默效率?- 沉默可達(dá)其它siRNAs的100倍 

· 高特異性?- 鎖核酸修飾最多可減少90% 的脫靶效應(yīng) 

· 高可信度?- 被廣泛證明的表型結(jié)果一致性 

· 高保障?- 100% 保證沉默效率，業(yè)內(nèi)最高保障 

使用 Silencer Select siRNA 進(jìn)行靶向基因沉默 

Silencer Select 設(shè)計(jì)算法 

· 包含>90 種不同的序列和熱力學(xué)參數(shù) 

· 與上一代 siRNA 設(shè)計(jì)算法相比，預(yù)測準(zhǔn)確性提高 28% 

· 給出的 siRNAs 沉默效率比其他供應(yīng)商的修飾和未修飾 siRNAs 高達(dá)100 倍 

· 與其他 siRNA 相比，在靶編輯百分比顯著提高 

大多數(shù) siRNA 設(shè)計(jì)算法給出的siRNAs，僅能以約 80% 的置信度 預(yù)測70% 的靶向 mRNA 沉默效率，而無法給出更有效的 siRNAs。許多 RNAi 應(yīng)用需要的沉默效率高于當(dāng)前算法提供的效率。因此，我們使用強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)方法和來自數(shù)千個(gè) siRNA 的性能數(shù)據(jù)來更好地了解 siRNA 的序列、靶標(biāo)位置和熱力學(xué)特性及其沉默效率之間的聯(lián)系。Silencer Select siRNA 設(shè)計(jì)算法油然而生。 

圖 1.Silencer Select siRNA 設(shè)計(jì)算法顯著提高了有效的 siRNA 預(yù)測準(zhǔn)確度。?Silencer Select siRNA 設(shè)計(jì)算法用于針對 40 個(gè)不同的靶標(biāo)設(shè)計(jì) 155 種 siRNAs。在 HeLa 細(xì)胞中使用這些 siRNAs 與舊版算法設(shè)計(jì)的siRNAs 進(jìn)行平行測試。在轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)使用 TaqMan 基因表達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)通過 qRT-PCR 測量 mRNA 敲低效果。結(jié)果表示為 Silencer Negative Control #1 siRNA 處理的細(xì)胞的 mRNA 表達(dá)量的百分比。插圖顯示了≥70% 和≥80% mRNA 敲低效果的 siRNAs 的百分比。 

增強(qiáng)特異性以減少脫靶效應(yīng) 

序列特異性脫靶效應(yīng)是 RNAi 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽性結(jié)果的主要原因之一。除了 Silencer Select 算法和生物信息學(xué)篩選標(biāo)準(zhǔn)提供的效力改進(jìn)之外，Silencer Select siRNA 還結(jié)合了經(jīng)證實(shí)可提高 siRNA 特異性的修飾技術(shù)。 

Silencer Select siRNAs 中的化學(xué)修飾： 

· ?持續(xù)增強(qiáng)引導(dǎo)鏈 (反義鏈) 偏向性，這已被證明與沉默效率密切相關(guān) 

· 防止過客鏈 (正義鏈) 誘導(dǎo)沉默，這有助于減少脫靶效應(yīng) 

o 與未修飾的 siRNA 相比，將基因表達(dá)陣列檢測到的非靶向、差異表達(dá)基因的數(shù)量減少多達(dá) 90% 

o 不會對沉默效率產(chǎn)生負(fù)面影響，因此不會影響預(yù)期的表型 

o 產(chǎn)生更清晰、更一致的細(xì)胞生物學(xué)數(shù)據(jù) 

圖 2.Silencer Select siRNA 修飾可減少脫靶效應(yīng)并產(chǎn)生更可靠的表型數(shù)據(jù)。53 種不同的 siRNAs，包括以前指出會引發(fā)脫靶效應(yīng)的舊設(shè)計(jì)，以 30 nM 的濃度將未修飾和 Silencer Select 修飾的 siRNAs 轉(zhuǎn)染到 U2OS 細(xì)胞中。48小時(shí)后測量有絲分裂和細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)以陰性對照 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對比展示。黑色 = 與對照相似的有絲分裂/凋亡水平。綠色 = 下調(diào)。紅色 = 上調(diào)。請注意，修飾未改變 PLK 和 WEE1 siRNAs 的預(yù)期有絲分裂和凋亡表型。相反，通過添加 Silencer Select 修飾消除了 10 個(gè)未修飾 siRNAs 介導(dǎo)的脫靶凋亡表型。 

圖 3.Silencer Select siRNA 修飾可減少差異表達(dá)的脫靶基因的數(shù)量。三個(gè)帶有和不帶有 Silencer Select 修飾的陰性對照 siRNA 分別以 30 nM 濃度轉(zhuǎn)染到 HeLa 細(xì)胞中。在 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 上提取和分析 RNA，共進(jìn)行三次。y 軸表示差異表達(dá)基因的平均數(shù)量——與模擬轉(zhuǎn)染樣品相比，表達(dá)變化≥2 倍的基因。 

高保障的沉默效率 

100 % 保證 – 業(yè)內(nèi)最佳 

在 Thermo Fisher Scientific，我們保證當(dāng)您購買兩個(gè) Invitrogen Silencer Select 預(yù)先設(shè)計(jì)的針對同一靶標(biāo)的 siRNA 時(shí)，這兩個(gè) siRNAs 將使靶標(biāo) mRNA 沉默 70% 或更多。要獲得保證，siRNA 必須在 ≥5 nM 濃度下轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)檢測 mRNA 水平。 

經(jīng)過 Silencer Select 驗(yàn)證的 siRNA 

針對人類靶標(biāo)的一部分 Invitrogen siRNAs 已在內(nèi)部進(jìn)行了功能測試，并經(jīng)驗(yàn)證可將靶標(biāo) mRNA 水平降低 70% 或更多，使我們能夠保證這些經(jīng)過 Silencer Select 驗(yàn)證的 siRNAs 將沉默其靶標(biāo)基因。這些 siRNA 的數(shù)據(jù)表展示了在測試期間觀察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外顯子。對于大多數(shù)類型，還免費(fèi)提供完整的序列信息。 

免費(fèi)獲取 Silencer Select siRNA 序列和相關(guān)數(shù)據(jù) 

近年來，siRNA 篩選突出了該技術(shù)的問題，這些問題源于脫靶效應(yīng)、不穩(wěn)定的沉默效率以及篩選結(jié)果的低水平置信度。 

美國國立衛(wèi)生研究院的研究人員在《自然》雜志上發(fā)表的全基因組篩選文章強(qiáng)調(diào)了一種有效的方法來規(guī)避篩選研究目前面臨的挑戰(zhàn)。本文獻(xiàn)重點(diǎn)介紹了從種子區(qū)域產(chǎn)生的假陽性中篩選獲取真陽性的新生物信息學(xué)技術(shù)。種子序列驅(qū)動的脫靶效應(yīng)已在 siRNA 篩選中廣泛觀察到，因?yàn)樗鼈冊从诜N子驅(qū)動的 mRNA 調(diào)節(jié)的內(nèi)源性 miRNA 機(jī)制。這項(xiàng)開創(chuàng)性的工作突出了作為單個(gè)排列的在較低 siRNA 濃度下使用高效 Silencer Select siRNA，從而可以識別源自種子序列的脫靶（假陽性或假陰性）。這種解卷積不能用于混合型 siRNA 篩選 (由于兩個(gè)或多個(gè) siRNA 以協(xié)同方式工作，因此可以觀察到生物學(xué)特性)。 

國家科學(xué)轉(zhuǎn)化促進(jìn)中心 (NCATS) 和 Thermo Fisher Scientific 為所有研究人員提供了從人類全基因組 Silencer Select siRNA 文庫中獲取 siRNA 序列和 PubChem 相關(guān)數(shù)據(jù)的途徑，該文庫包括針對 20,000 多個(gè)人類基因的 65,000 條 siRNA 序列。 

高質(zhì)量的 RNA 合成 

我們在經(jīng)過 ISO13485 和 ISO9001 認(rèn)證的設(shè)施中合成和純化每條 siRNA，以滿足最高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。作為我們嚴(yán)格質(zhì)量控制程序的一部分，每個(gè) RNA 寡核苷酸都通過 LCMS 和/或分析型 HPLC 進(jìn)行分析。結(jié)果是被純化并可以直接使用的優(yōu)質(zhì) siRNA 。 

如需合作轉(zhuǎn)載本文，請文末留言。 

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