巨噬細(xì)胞的主要功能概述

巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)特化的，存活時(shí)間長(zhǎng)，具有吞噬作用的細(xì)胞。它們與中性粒細(xì)胞一起，是感染的第一反應(yīng)者[1]。巨噬細(xì)胞參與細(xì)胞碎片和病原體的識(shí)別、吞噬和降解[2]。巨噬細(xì)胞還在向T細(xì)胞提呈抗原以及誘導(dǎo)其他抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)共刺激分子等方面發(fā)揮作用，從而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[1]。此外，在炎癥初期，它們通過(guò)釋放細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮重要作用，這些細(xì)胞因子和趨化因子反過(guò)來(lái)將其他免疫細(xì)胞募集到炎癥部位[3]。

巨噬細(xì)胞的主要功能

巨噬細(xì)胞存在于大部分組織中，因此具有不同的功能。除了能啟動(dòng)對(duì)病原體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞還維持組織穩(wěn)態(tài)以及組織的修復(fù)和重塑發(fā)揮作用[4] [5]。不幸的是，這種功能與許多疾病有關(guān)，包括代謝和自身免疫性疾病、癌癥、感染、肥胖和纖維化[5] [6]。因此，巨噬細(xì)胞似乎在腫瘤微環(huán)境中也起著關(guān)鍵作用，特別是在基質(zhì)重塑、血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展中[5]。

巨噬細(xì)胞的發(fā)育

巨噬細(xì)胞的來(lái)源很多。駐留在組織中的巨噬細(xì)胞可以從循環(huán)單核細(xì)胞中分化出來(lái)，循環(huán)單核細(xì)胞由骨髓中的造血干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，也可以在胚胎發(fā)育過(guò)程中在胎肝、卵黃囊或背主動(dòng)脈附近的胚胎區(qū)域生成，因此在成年期獨(dú)立于單核細(xì)胞而存在[3] [5] [6]。前一種發(fā)育是通過(guò)單核細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下或炎癥時(shí)遷移到組織中實(shí)現(xiàn)的，隨后分化為持續(xù)性的組織特異巨噬細(xì)胞，包括骨巨噬細(xì)胞（破骨細(xì)胞）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（小膠質(zhì)細(xì)胞）、結(jié)締組織（組織細(xì)胞）和肝臟（庫(kù)普弗細(xì)胞），以及肺泡巨噬細(xì)胞（噬塵細(xì)胞）、腸、脾和腹膜[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞能夠在存在白細(xì)胞介素34 （IL-34）的情況下自我更新，IL-34表達(dá)于這些組織，并與巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的受體結(jié)合[3]。由于它們分布和作用于多種不同組織和器官中，因此巨噬細(xì)胞具有多種形態(tài)和表型[5]。

圖 1.巨噬細(xì)胞發(fā)育。單核細(xì)胞由骨髓中的造血干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，并經(jīng)歷幾個(gè)分化步驟。單核細(xì)胞作為常駐單核細(xì)胞或有炎癥時(shí)作為炎性單核細(xì)胞遷移到常駐組織中。遷移到組織后，分化為組織特異性巨噬細(xì)胞。從源[7]修改的圖像。

巨噬細(xì)胞是吞噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞是除粒細(xì)胞（嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）之外的三種吞噬細(xì)胞類(lèi)型之一。微生物一旦進(jìn)入宿主并開(kāi)始復(fù)制，這些吞噬細(xì)胞中的一種就會(huì)將其識(shí)別并吞噬破壞，這一過(guò)程稱(chēng)為吞噬作用。大多數(shù)病原體通過(guò)呼吸系統(tǒng)、腸粘膜、皮膚損傷或泌尿生殖道進(jìn)入宿主。由于巨噬細(xì)胞聚集在粘膜下層組織中，它們通常是第一個(gè)遇到病原體的防御細(xì)胞。當(dāng)某些吞噬細(xì)胞受體（通常是病原體的碳水化合物或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)）與病原體表面相互作用時(shí)，吞噬作用就開(kāi)始了[3]。

在第一次相互作用后，吞噬細(xì)胞質(zhì)膜將病原體包圍并內(nèi)化在一個(gè)被稱(chēng)為吞噬體的大膜包裹的內(nèi)吞囊泡中。然后吞噬體與一個(gè)或多個(gè)溶酶體融合，形成吞噬溶酶體，溶酶體是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶體內(nèi)容物被釋放到吞噬溶酶體中，吞噬溶酶體反過(guò)來(lái)經(jīng)歷酸化和酶促過(guò)程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基來(lái)殺死病原體[3]。

關(guān)于吞噬細(xì)胞受體的兩個(gè)例子是Dectin-1和甘露糖受體(CD206)。兩者都是C型凝集素樣家族的成員。Dectin-1由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)，并與真菌細(xì)胞壁中常見(jiàn)的葡萄糖聚合物結(jié)合。CD206由巨噬細(xì)胞和DC表達(dá)，并與真菌、細(xì)菌和病毒共有的多種甘露糖基化配體結(jié)合[3]。

圖 2.吞噬作用。第一組：組織巨噬細(xì)胞攜帶多種表面受體，其中一些是吞噬作用所必需的。甘露糖受體可識(shí)別細(xì)菌、真菌和病毒上的甘露糖基化配體。Dectin-1與真菌細(xì)胞壁上的某些葡萄糖聚合物結(jié)合。補(bǔ)體受體結(jié)合并內(nèi)化補(bǔ)體包裹的細(xì)菌。大多數(shù)吞噬作用受體可識(shí)別病原體特異性的碳水化合物或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。第二組：吞噬作用發(fā)生后，吞噬體與一個(gè)或多個(gè)溶酶體融合，生成吞噬溶酶體。

巨噬細(xì)胞分類(lèi)與分型

巨噬細(xì)胞的分類(lèi)仍然是一個(gè)非常有爭(zhēng)議的話(huà)題，不同的因素會(huì)導(dǎo)致不同的表型和巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)，包括信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制和變化，以及小生境信號(hào)，如細(xì)胞因子、細(xì)胞間接觸物和代謝物[5] [8] [9]。此外，面對(duì)微生物及其產(chǎn)物，如脂多糖（LPS）[10]，巨噬細(xì)胞可以調(diào)節(jié)自身的活化狀態(tài)。然而，巨噬細(xì)胞的活化在組織穩(wěn)態(tài)以及炎癥和疾病進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[5]。一般來(lái)說(shuō)，巨噬細(xì)胞可以根據(jù)其功能和活化作用進(jìn)行分類(lèi)，并分為兩種亞型：經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞和替代活化的M2巨噬細(xì)胞。

圖 3.M1和M2巨噬細(xì)胞的分化。M1和M2巨噬細(xì)胞響應(yīng)多種因素，包括信號(hào)分子、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞間接觸物和代謝物。

典型活化態(tài)的M1巨噬細(xì)胞

M1巨噬細(xì)胞主要通過(guò)天然和適應(yīng)性免疫反應(yīng)在Th1細(xì)胞募集、病原體抵抗和腫瘤控制中發(fā)揮作用[13]。M1巨噬細(xì)胞通常由病原體、LPS、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和1型輔助性T （Th1）細(xì)胞因子干擾素γ（IFN-γ）活化。許多通路能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路[14]。

從特征上說(shuō)，M1巨噬細(xì)胞抗原呈遞活性強(qiáng)和分泌促炎細(xì)胞因子多，如白細(xì)胞介素1 （IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS） [12]。此外，它們下調(diào)IL-12和IL-23和IL-10的表達(dá)[13] [5]。M1巨噬細(xì)胞的刺激導(dǎo)致 IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬細(xì)胞表型表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合體II類(lèi)（MHC II）、CD68、CD80和CD86，以及針對(duì)Th1細(xì)胞的趨化因子，包括CXCL9和CXCL12 [12]。

表 1.人M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。這些標(biāo)志物可用于區(qū)分M1巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型。

表 2.小鼠M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。這些標(biāo)志物可用于區(qū)分M1巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型。

替代活化型M2巨噬細(xì)胞

M2巨噬細(xì)胞可由寄生蟲(chóng)或真菌感染、免疫復(fù)合物、凋亡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型輔助性T細(xì)胞因子 （Th2）IL-4、IL-33和IL-25通過(guò)Th2細(xì)胞替代活化[12] [15]。促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M2狀態(tài)的潛在信號(hào)包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ [11]。

與經(jīng)典活化亞型相反，替代活化的亞型表達(dá)相反的表達(dá)譜：下調(diào)IL-12和IL-23，上調(diào)IL-10和IL-1RA [13] [5]。此外，M2巨噬細(xì)胞表達(dá)較低的炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬細(xì)胞在病原體清除、抗炎反應(yīng)和代謝以及傷口愈合、組織重塑、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤進(jìn)展和惡性腫瘤中發(fā)揮作用[12] [15]。

M2表型的特點(diǎn)是表達(dá)CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般來(lái)說(shuō)，這種亞型高效表達(dá)吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受體，以及能通過(guò)精氨酸酶通路增加鳥(niǎo)氨酸和多聚氨基酸的產(chǎn)生[12]。這種類(lèi)型的巨噬細(xì)胞表達(dá)的趨化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24 [11]。

M2巨噬細(xì)胞亞型

針對(duì)巨噬細(xì)胞不同的刺激，已知有四種M2亞型：M2a、M2b、M2c和M2d。這些亞型因其細(xì)胞表面標(biāo)志物、分泌的細(xì)胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬細(xì)胞亞型都共同表達(dá)IL-10[11]。

l M2a巨噬細(xì)胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反過(guò)來(lái)促進(jìn)甘露糖受體（CD206）的表達(dá)。經(jīng)證實(shí)，進(jìn)一步上調(diào) IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)和胞吞作用[11]。

l M2b巨噬細(xì)胞：由免疫復(fù)合物、Toll樣受體（TLR）配體和IL-1b活化?；罨?，這種亞型釋放促炎和抗炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[11]。

l M2c巨噬細(xì)胞：由糖皮質(zhì)激素、IL-10和TGF-b（和滅活的巨噬細(xì)胞）活化。這種亞型的特征是高效表達(dá)抗炎IL-10、促纖維化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受體酪氨酸激酶（MerTK）[16]，其中MerTK能促進(jìn)凋亡細(xì)胞吞噬。

l M2d巨噬細(xì)胞：由TLR拮抗劑、IL-6和腺苷活化。腺苷促進(jìn)IL-10和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，這個(gè)過(guò)程能加劇血管生成和腫瘤進(jìn)展[11] [16]。

表 3.人M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。這些標(biāo)志物可用于區(qū)分M2巨噬細(xì)胞和其他類(lèi)型的細(xì)胞。

表 4.小鼠M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。這些標(biāo)志物可用于區(qū)分M2巨噬細(xì)胞和其他類(lèi)型的細(xì)胞。

疾病中的巨噬細(xì)胞

作為免疫系統(tǒng)的一部分，巨噬細(xì)胞除了在對(duì)抗疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用之外，在慢性炎癥、自身免疫性疾病和癌癥中也發(fā)揮負(fù)向作用。在常規(guī)免疫反應(yīng)中，促炎巨噬細(xì)胞受到抑制，致使其促炎信號(hào)減弱。在長(zhǎng)期損傷過(guò)程中，失調(diào)的巨噬細(xì)胞持續(xù)分泌炎性細(xì)胞因子并且募集其他免疫細(xì)胞。這些過(guò)程維持慢性炎癥，被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。一旦腫瘤形成，就會(huì)使巨噬細(xì)胞從免疫活性狀態(tài)分化為免疫抑制狀態(tài)。在大多數(shù)癌癥中，這些所謂的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）高度密集，均與患者預(yù)后不良有關(guān)。在傷口愈合過(guò)程中，如果免疫反應(yīng)控制不夠，巨噬細(xì)胞也可能導(dǎo)致纖維化。對(duì)于其他慢性病包括動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、炎性腸病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]，巨噬細(xì)胞也起關(guān)鍵作用。

巨噬細(xì)胞研究方法

可以從全血（PBMC分離、巨噬細(xì)胞分析、單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞）或組織或腫瘤（組織或腫瘤樣本的單細(xì)胞懸液制劑）中分離和分析巨噬細(xì)胞。此外，人和小鼠單核細(xì)胞系有商業(yè)化的產(chǎn)品，包括THP-1細(xì)胞（急性單核細(xì)胞白血?。?、U937細(xì)胞（組織細(xì)胞淋巴瘤）以及RAW264.7細(xì)胞（小鼠白血病單核巨噬細(xì)胞）和J774A.1細(xì)胞（小鼠BALB/c單核巨噬細(xì)胞）[17]。

有多種方法可以分離巨噬細(xì)胞，包括磁珠細(xì)胞分選、密度梯度分離、激光捕獲顯微解剖和流式細(xì)胞儀分選法（FACS） [18]。分離后，可以通過(guò)基因表達(dá)分析、功能研究、細(xì)胞因子和趨化因子生成的評(píng)估以及使用免疫熒光染色、免疫檢定、流式細(xì)胞儀、免疫印跡或聚合酶鏈反應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞表面標(biāo)志物來(lái)分析和表征巨噬細(xì)胞功能和表型。請(qǐng)注意，并非每種分析方法均需要分離巨噬細(xì)胞[18]。

巨噬細(xì)胞分離

當(dāng)分析或處理來(lái)自組織或腫瘤的巨噬細(xì)胞時(shí)，通常制備組織或腫瘤切片或單細(xì)胞懸液。組織或腫瘤切片可直接用于免疫組織化學(xué)（IHC）染色和分析。為了制備單細(xì)胞懸液，需要解剖組織或腫瘤，然后進(jìn)行酶消化。單細(xì)胞懸浮液可以直接用于表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞術(shù)分析等方法

當(dāng)需要時(shí)，可以使用激光捕獲顯微解剖和流式細(xì)胞儀分選法（FACS）或磁珠細(xì)胞分選試劑盒分離巨噬細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)行分離時(shí)，使用針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記的熒光染料偶聯(lián)的抗體對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行染色，然后使用細(xì)胞分選儀根據(jù)定義的分選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行分選。使用抗體磁珠細(xì)胞分離試劑時(shí)，細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的特異性抗體接合在磁珠上，細(xì)胞懸液會(huì)繼續(xù)帶有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗體與目標(biāo)細(xì)胞的表面標(biāo)志物結(jié)合，再洗去未結(jié)合的非目標(biāo)細(xì)胞，就可得到與磁珠結(jié)合的目標(biāo)細(xì)胞

此外，可以進(jìn)一步培養(yǎng)和刺激分離的巨噬細(xì)胞。通常，M1巨噬細(xì)胞可以通過(guò)刺激被重新編程為M2巨噬細(xì)胞，反之亦然。巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)可用于刺激或生成細(xì)胞裂解物或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其可用于qPCR檢測(cè)、免疫印跡或各種免疫檢測(cè)（IA），包括ELISA、基于磁珠的免疫檢測(cè)（如Invitrogen ProcataPlex多因子試劑盒）和基于PCR的免疫檢測(cè)（如Invitrogen ProQuantum高靈敏度免疫檢測(cè)，用于各種細(xì)胞因子的定量）。也可以通過(guò)檢測(cè)吞噬作用來(lái)研究巨噬細(xì)胞功能[17]。

當(dāng)從全血中分析或處理巨噬細(xì)胞時(shí)，常用步驟是分離單核細(xì)胞并且將其分化為巨噬細(xì)胞。因此，使用Ficoll Paque通過(guò)密度梯度分離從全血中分離PBMC。這種方法利用了全血中不同細(xì)胞類(lèi)型之間的密度差異。隨后，使用FACS流式分選或磁珠細(xì)胞分選試劑盒從PBMC懸液中分離CD14+單核細(xì)胞，例如，采用InvitrogenInvitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit（類(lèi)別編號(hào)11350D）、InvitrogenInvitrogen DynabeadsCD14（類(lèi)別編號(hào)11149D），或InvitrogenInvitrogen DynabeadsFlowComp人CD14試劑盒（類(lèi)別編號(hào)11367D）。另一種經(jīng)濟(jì)高效的分離方法是在組織培養(yǎng)塑料器皿中培養(yǎng)PBMC懸浮液，單核細(xì)胞優(yōu)先粘附在其上;使用明膠涂層表面會(huì)增加單核細(xì)胞數(shù)量。

巨噬細(xì)胞體外分化

有多種刺激/分化技術(shù)能在體外獲得原代巨噬細(xì)胞或極化M1或M2巨噬細(xì)胞。如果不需要進(jìn)一步分離單核細(xì)胞，則分離的PBMC可通過(guò)與含15%胎牛血清（FCS）的Gibco RPMI 1640培養(yǎng)基一起培養(yǎng)直接生成巨噬細(xì)胞。

分離的單核細(xì)胞可以使用特殊的分化培養(yǎng)基分化成原代巨噬細(xì)胞。例如，使用生長(zhǎng)因子GM-CSF和M-CSF可以使單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。可以在RPMI 1640培養(yǎng)基中刺激單核細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF（Gibco GM-CSF重組人蛋白，貨號(hào)PHC2013）或10ng/mL M-CSF（Gibco M-CSF重組人蛋白，貨號(hào)PHC9501）持續(xù)7天，能導(dǎo)致M1和M2巨噬細(xì)胞分化。刺激后，細(xì)胞以細(xì)長(zhǎng)形狀粘附于培養(yǎng)皿表面。

另外，可以用不同的細(xì)胞因子先后刺激單核細(xì)胞來(lái)獲得M1和M2極化巨噬細(xì)胞。用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的細(xì)胞，隨后用10ng/mL脂多糖處理24小時(shí)（Invitrogen eBioscience脂多糖（LPS）溶液， 貨號(hào)00-4976-03）和50ng/mL IFN-γ（Gibco IFN-γ重組人蛋白，貨號(hào) PHC4031）以獲得M1巨噬細(xì)胞或添加20ng/mL IL-4（Gibco IL4重組人蛋白，貨號(hào)PHC0041）可獲得M2/M2a巨噬細(xì)胞。用免疫復(fù)合物和IL-1b或LPS處理能促進(jìn)M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮質(zhì)激素則能促進(jìn)M2c活化 [14] [19] [20]?？梢允褂妹庖呓M織化學(xué)染色或流式細(xì)胞儀分析其表面表達(dá)的標(biāo)志物來(lái)識(shí)別巨噬細(xì)胞類(lèi)型（表5）。

巨噬細(xì)胞的識(shí)別和表征

表5列出了可用于識(shí)別巨噬細(xì)胞（一般表型）及其表征（功能特征）的標(biāo)志物。標(biāo)記物的位置(表面或細(xì)胞內(nèi))對(duì)檢測(cè)這些抗原的方法有影響。

表 5.近期已知的細(xì)胞標(biāo)記物列表。列出的標(biāo)志物可用于區(qū)分人和小鼠巨噬細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀-識(shí)別巨噬細(xì)胞的示例

雖然傳統(tǒng)的M1/M2模型可以用于體外培養(yǎng)和刺激，來(lái)探索不同類(lèi)型的巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)，但對(duì)組織巨噬細(xì)胞復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的新認(rèn)識(shí)清楚地表明，其無(wú)法充分描述這些細(xì)胞在體內(nèi)的功能和表型多樣性[21] [22]。 因此，我們建議基于多種標(biāo)志物的表達(dá)和功能特征，采用更靈活和更全面的方法來(lái)代替過(guò)分簡(jiǎn)化的M1/M2模型。然而，用于定義M1和M2表型的經(jīng)典標(biāo)志物仍然在巨噬細(xì)胞表征中發(fā)揮重要作用。在這里，我們定義了一些傳統(tǒng)的標(biāo)志物，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受體（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬細(xì)胞。

iNOS和精氨酸酶1

巨噬細(xì)胞（至少在小鼠細(xì)胞中）經(jīng)典激活型和替代活化型的標(biāo)志物分別為iNOS和Arg1（圖4）。iNOS是一種酶，可催化L-精氨酸的NADPH依賴(lài)性氧化反應(yīng)生成L-瓜氨酸和一氧化氮（NO）。一氧化氮是細(xì)胞毒性和其他生理功能（例如，血管舒張）的重要介質(zhì)。iNOS在巨噬細(xì)胞中不是組成型表達(dá)，其存在能表明此前用促炎細(xì)胞因子（如IL-1、TNF-α或IFN-γ）刺激的結(jié)果。

Arg1酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素和L-鳥(niǎo)氨酸。通過(guò)降解精氨酸，Arg1占據(jù)了iNOS的底物，并且下調(diào)一氧化氮生成。IL-4和IL-13強(qiáng)烈誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Arg1，而不是由抗炎細(xì)胞因子（如IL-10或TGF-b）誘導(dǎo)。與iNOS表達(dá)相反，在多個(gè)組織巨噬細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)Arg1有表達(dá)。例如，大多數(shù)小鼠大腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 高巨噬細(xì)胞）在穩(wěn)態(tài)下呈Arg1陽(yáng)性。如圖4所示，甚至可以在一些受IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到Arg1。因此，Arg1不應(yīng)被視為M2極化的特異性標(biāo)記，尤其是分析原代未培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)。

圖 4.用IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞主要表達(dá)iNOS，小部分亞群表達(dá)iNOS和低水平的Arg1。IL-4刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)Arg1而不表達(dá)iNOS。C57BL/6小鼠骨髓衍生巨噬細(xì)胞采用LPS和IFN-γ（M1）或IL-4（M2a）處理24小時(shí)，隨后用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號(hào)48-4801-82）進(jìn)行表面染色。然后用nvitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer SetI（貨號(hào)88-8824-00）固定和透化細(xì)胞，隨后用Invitrogen iNOS單克隆抗體（克隆CXNFT）、APC（貨號(hào)17-5920-82）和Invitrogen精氨酸酶1單克隆抗體（克隆A1exF5）、PE（貨號(hào)12-3697-82）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。存活F4/80+細(xì)胞用于分析。

甘露糖受體（CD206）

巨噬細(xì)胞甘露糖受體，稱(chēng)為CD206或甘露糖受體C類(lèi)型1（MRC1），介導(dǎo)真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物和病毒抗原的吞噬和內(nèi)吞攝取，并且在免疫防御及其調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。甘露糖受體是替代活化巨噬細(xì)胞的原始識(shí)別標(biāo)志物。與Arg1相反，CD206廣泛地在替代活化型巨噬細(xì)胞中表達(dá)，包括用IL-10或糖皮質(zhì)激素處理的耐受性細(xì)胞。有趣的是，TGF-b被證明可以下調(diào)CD206的表達(dá)。抑制這種受體表達(dá)的其他因素包括LPS、IFN-γ和TNF-α。與Arg1相似，CD206組成型表達(dá)于多種類(lèi)型的組織巨噬細(xì)胞中，盡管它與Arg1的表達(dá)模式不重疊。圖5中的右組顯示了CD206在?。‵4/80 lo）和大（F4/80 hi）腹膜巨噬細(xì)胞中的組成性表達(dá)。

圖5.大量小鼠小腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 lo）和大腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 hi）的組成性表達(dá)CD206。用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號(hào)48-4801-82）對(duì)小鼠常駐腹膜滲出細(xì)胞進(jìn)行表面染色，隨后用Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（貨號(hào)88-8824-00）進(jìn)行固定和透化。然后用Invitrogen大鼠IgG2b同種型對(duì)照（克隆eB149/10H5）、APC （貨號(hào)17-4031-82（左組）或Invitrogen CD206單克隆抗體（克隆MR6F3）、APC（貨號(hào)17-2061-80（右組）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色。總細(xì)胞用于分析；大多數(shù)雙陰性細(xì)胞為B細(xì)胞。

RELM-a（FIZZ1）

RELM-a，也稱(chēng)為抵抗素樣α或FIZZ1，是一種由IL-4和IL-13強(qiáng)烈誘導(dǎo)的小細(xì)胞因子，參與抵抗寄生蟲(chóng)感染的反應(yīng)。與Arg1相似，糖皮質(zhì)激素和IL-10不能誘導(dǎo)RELM-a。盡管如此，這兩種常用的M2活化標(biāo)志物的在體內(nèi)表達(dá)的模式非常不同。例如，在沒(méi)有刺激的情況下，大多數(shù)小腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 lo）和少數(shù)大腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 hi）表達(dá)RELM-a（圖6）。

圖6.大多數(shù)小腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 lo）和極少數(shù)大腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 hi）自發(fā)表達(dá)RELM-a。C57BL/6小鼠常駐腹膜滲出細(xì)胞用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號(hào)48-4801-82）進(jìn)行表面染色。然后用Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（貨號(hào)88-8824-00）固定和透化細(xì)胞，并且用Invitrogen大鼠IgG1同種型對(duì)照（克隆eBRG1）、APC（貨號(hào)17-4301-82（左組）或Invitrogen RELMα單克隆抗體（克隆DS8RELM）、APC（貨號(hào)17-5441-82）（右組）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色。所有腹膜細(xì)胞用于分析；大多數(shù)雙陰性細(xì)胞為B細(xì)胞。

CD163

CD163為觸珠蛋白和血紅蛋白受體。由于CD163的主要功能是促進(jìn)鐵的再循環(huán)過(guò)程，因此在脾紅髓巨噬細(xì)胞中可以觀察到CD163的最高表達(dá)。CD163還可以用于檢測(cè)某些細(xì)菌化合物，并且在組織巨噬細(xì)胞的其他亞群中表達(dá)，包括Kupffer c細(xì)胞、腸固有層巨噬細(xì)胞和一部分大腹膜巨噬細(xì)胞（圖7），盡管表達(dá)程度較低。與人CD163不同，小鼠CD163不容易由M2極化細(xì)胞因子誘導(dǎo)，故不是鼠科動(dòng)物M2巨噬細(xì)胞的良好標(biāo)志物。相反，其表達(dá)似乎表明了組織特異性巨噬細(xì)胞功能（例如，血紅蛋白再循環(huán)）

圖7.很大一部分大腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 hi）和幾乎沒(méi)有小腹膜巨噬細(xì)胞（F4/80 lo）組成性表達(dá)CD163。BALB/c小鼠脾細(xì)胞用Invitrogen F4/80單克隆抗體（克隆BM8）、eFluor 450（貨號(hào)48-4801-82）和Invitrogen大鼠IgG2a同種型對(duì)照（克隆eBR2a）、PerCP-eFluor 710（類(lèi)別編號(hào)46-4321-82）（左組）或Invitrogen CD163單克隆抗體（克隆TNKUPJ）、PE（貨號(hào)12-1631-82)（右組）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色。總細(xì)胞用于分析。

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