本研究采用4種不同類型的CHO細胞系、8個不同的克隆、4種不同的規(guī)模(2L、7L、15L和10000L)，在標稱操作條件(NOC)下分批補料和灌注兩種培養(yǎng)模式進行35次培養(yǎng)。表1總結(jié)了可用的批次，參考了它們各自的條件(探索了八種不同的批次條件或因素)。這些用于標記每個批次的光譜數(shù)據(jù)。

較小的生物反應(yīng)器(最多15升)是玻璃容器(Applikon Biotechnology，荷蘭)，而生產(chǎn)10000升的生物反應(yīng)器是不銹鋼容器。所有儀器都配備了pH值、溫度、溶解氧探針和拉曼探針。使用Kaiser Raman Rxn2 (Kaiser Optical Systems, USA)儀器。拉曼系統(tǒng)配備785 nm激發(fā)激光系統(tǒng)和四個浸沒探針，長度分別為120mm(10000L容器)，220mm(2L容器)和420mm(7和15L容器)。光譜采集范圍為400-1800cm?1，掃描75次，每次掃描10s。大約每天從每個反應(yīng)器中抽取一次樣本進行參考分析。葡萄糖和乳酸使用NOVA Biomedical (Massachusetts, USA)的BioProfile FLEX進行分析。蛋白質(zhì)濃度采用高效液相色譜專有定量方法進行分析。

本研究中的風險評估由分析方法開發(fā)和哺乳動物細胞生物工藝開發(fā)方面的多學科專家團隊進行。專家們根據(jù)嚴重性(S)、發(fā)生率(O)和可檢測性(D)對風險進行了評估，并將獲得合適條件（高蛋白濃度、產(chǎn)量和高存活細胞密度）這一目標的風險作為評估的問題陳述。在評估過程中，根據(jù)這些因素的乘積RPN對每種條件進行排序。然后，通過標準的故障模式和影響分析法（FMEA）完成風險評估工作。潛在因素分為兩類，一類取決于批次條件，另一類則不取決于批次條件。取決于批次變化的風險因素被稱為不可控因素，可能帶來隨機或系統(tǒng)誤差（如與離線測量相關(guān)的誤差）。風險評分與批次演變無關(guān)的因素，即初始批次條件，可在培養(yǎng)前通過選擇適當?shù)氖芸嘏螚l件來降低。對于RPN值低于200且與批次變化無關(guān)的風險，則不予考慮。

在三十五個批次中獲取的所有光譜均被導(dǎo)入Matlab8.5 2015（MathWorks，Natick，MA，USA）。每個批次由經(jīng)過光譜預(yù)處理的12個點的平均值組成：第1次導(dǎo)數(shù)（25點窗口），然后是標準正態(tài)變異（SNV）。在批次級分析中，所有收集到的光譜都按時間順序排列，以創(chuàng)建批次進化模型（BEM）。通過主成分分析法（PCA），利用該模型的得分建立批次水平模型（BLM）。在BLM的得分圖中，每個點代表三十五個批次中的一個，它們在圖中的位置由光譜變異性決定。在本地模型分析中，光譜數(shù)據(jù)分類的較小單位是批次。具有相同特征的批次組（例如，所有2L批次）以等級表示。與某類批次特征（如刻度）相關(guān)的級別組被稱為批次條件。批次條件之間的關(guān)系相同的，則視為處于連續(xù)的階段（例如，每個細胞系（階段1）可衍生為不同的克隆（階段2））。數(shù)據(jù)使用偏最小回歸法（PLS）建立模型，其中拉曼位移為自變量（X變量），離線代謝物和蛋白質(zhì)濃度測定為因變量（Y變量）。模型的整體性能以均方根e。

模型建立過程包括利用35個批次的所有可用光譜數(shù)據(jù)創(chuàng)建PLS模型（通用模型），同時利用特定級別（一個或多個不同批次）的不同光譜數(shù)據(jù)集創(chuàng)建較小的PLS模型（局部模型）。創(chuàng)建局部模型采用了兩種策略。第一種策略是在批次條件的指導(dǎo)下建立本地模型。對于每個模型，校準集由在特定條件下收集的所有光譜構(gòu)成，但校準集中不包括特定級別的光譜。這種"只留一級"的策略被稱為"排除級局部建模（ELL）"。因此，對于每個批次條件，我們將根據(jù)每個批次條件中的等級數(shù)量來建立相同數(shù)量的 ELL 模型。第二種策略是只使用與單個級別相對應(yīng)的光譜來建立局部模型。我們稱這種策略為單級局部（SLL）建模。對于每個批次條件，我們的SLL模型數(shù)量與每個批次條件中的等級數(shù)量相同。圖1以批次條件"克隆"為例說明了上述校準策略。

 

通過確定最小 RPN 值為 200，我們可以將重點放在8個可能事先影響拉曼信號的潛在風險的影響上（表1）。

圖3顯示了批次級PCA前兩個主成分的得分。相同的得分圖以倍數(shù)表示（A至H），并根據(jù)不同的批次條件使用不同的色標。35個批次的得分圖呈現(xiàn)出四個主要群組（CL1至CL4）。當按比例對評分圖著色時（圖3-A），CL1組對應(yīng)15升批次（深藍色）；CL2組對應(yīng)2升批次（淺藍色）和單個7升批次（淺綠色）；CL3組對應(yīng)2升批次（淺藍色）；CL4組對應(yīng)10000升批次（紅色）。當按培養(yǎng)基對得分圖著色時（圖3-B），群組CL1同時對應(yīng)培養(yǎng)基1（深藍色）和培養(yǎng)基3（紅色）；培養(yǎng)基2（淺綠色）在該圖的其余群組上被識別。在其余批次條件下，同樣的聚類識別并不清晰。當按培養(yǎng)模式對得分圖著色時（圖3-C），CL3和CL4組分別對應(yīng)于灌流和分批培養(yǎng)，而CL1和CL2組則顯示出兩種培養(yǎng)模式的混合。按細胞系（圖3-D）、最終培養(yǎng)基成分（圖3-E）、主要進料（圖3-F）、克隆（圖3-G）和培養(yǎng)基批次（圖3-H）著色時也呈現(xiàn)出同樣的趨勢，其中CL1和CL2顯示出多個不同級別的批次。

為了比較每個批次條件下各層次生成的所有局部模型，本研究采用了一種類似于控制圖的可視化方法，其中x軸對應(yīng)于每個批次條件。所有散點表示每個局部模型在各自批次條件下的RMSECv。中心虛線用作基線，表示使用每種分析物的所有可用數(shù)據(jù)計算的通用模型RMSECv值（通用 RMSECv）。虛線上下的黃線分別表示一般模型RMSECv的±25%。上下紅線的作用相同，表示一般模型RMSECv的±50%。在ELL模型中，RMSECv 值與一般RMSECv的變化量不同于SLL模型。如果ELL和SLL模型的RMSECv值低于一般模型的該參數(shù)，則該分析將認為ELL和SLL模型是可接受的。換句話說，所有批次條件都要求其所有局部模型的RMSECv值低于每個一般模型的0%。

圖4是葡萄糖的ELL模型和SLL模型

圖5是乳酸濃度的ELL模型和SLL模型

圖6是蛋白質(zhì)濃度的ELL模型和SLL模型

表2總結(jié)了針對8個批條件建立的局部模型的結(jié)果，包括批級PCA、級別模型和隨著獲得更多的過程相關(guān)知識，可以通過重復(fù)風險評估來重新評估現(xiàn)有的過程理解。使用批級PCA聚類分析、ELL和SLL建模、使用批次范圍和本地模型數(shù)量的每批條件輸出摘要。標記為黃色的RMSECv百分比表示所有本地模型在+25%和-50%的區(qū)間內(nèi)，綠色表示所有本地模型低于0%的批量條件。在至少一個本地型號高于±50%的批量條件下，用紅色標記的RMSECv百分比。

因此，表3中的初始風險評估可以使用批級PCA、ELL、SLL和用于局部模型的批次數(shù)的結(jié)果進行更新(表4)。初始風險分析(A)和最終風險分析(B)，基于批級PCA、ELL和SLL的結(jié)果，考慮了每個批條件的影響。

RMSECv是一個比預(yù)測均方根誤差(RMSEP)-外部預(yù)測更好的指標。這是因為不同的局部模型與外部預(yù)測之間的比較需要對兩個局部模型進行相同級別的驗證批次處理。RMSEP偏向于與驗證批次共享相同級別的局部模型。為每個局部模型使用定制的外部驗證批次不僅需要額外使用設(shè)備，而且還需要編譯所有RMSEP值，以便建立適當?shù)谋容^。使用模型的不同配置，以結(jié)構(gòu)的方式，并編譯所有不同的RMSEP值是RMSECv的最終目標，這使其成為本研究中合適的方式。

PAT方法的使用在工藝開發(fā)期間尤為重要。使用來自多個生物反應(yīng)器規(guī)模(即水平規(guī)模)的數(shù)據(jù)需要使用特定于每個生物反應(yīng)器規(guī)模的本地模型，無論是使用SLL還是ELL模型，按比例進行模型分類產(chǎn)生了可行的結(jié)果(見表3)，其中RMSECV不高于一般模型的10%。將這個方法用于葡萄糖和乳酸，并將這一結(jié)論擴展到蛋白質(zhì)濃度。一方面，單比例模型可以簡化規(guī)模放大，使用低成本的小批量作為校準來驗證大批量。

對于培養(yǎng)模式來說，分批培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)ELL和SLL建模都有互補的校準集。這種批次條件產(chǎn)生的局部模型在ELL和SLL建模中范圍廣，其中一些模型RMSECv高于通用模型的RMSECv。批次條件下的細胞系在使用SLL或ELL時，在相同范圍內(nèi)的局部模型都有較好的結(jié)果。

綜上所述，該研究證明與通用模型相比，使用以批量條件為導(dǎo)向的模型構(gòu)建策略，所有局部模型的預(yù)測誤差都會減小。使用少量批次（3-9個）就能生成預(yù)測誤差較低的局部模型，這可以作為生產(chǎn)階段的校準策略。批次條件也顯示使用類似的批次數(shù)量范圍（1-9），可產(chǎn)生較低的RMSECv值，是克隆的較好替代方案。

研究表明，評估影響拉曼光譜校準模型的因素是提高該監(jiān)測預(yù)測性能的關(guān)鍵。在工藝開發(fā)過程中，拉曼監(jiān)測模型提供準確和精確的預(yù)測，在許多工藝參數(shù)組合發(fā)生變化時同樣可以精準預(yù)測。比較通用模型的RMSECv和特定本地模型的RMSECv，用于每個批次條件下的單個過程特征。通過構(gòu)建這些局部模型的方法，比較了通用模型(ELL建模)中每個層次對模型的影響和僅使用單個層次(SLL建模)對模型的影響。對于有效的局部建模策略，當使用多種工藝數(shù)據(jù)進行校準時，基于培養(yǎng)基或細胞生成的局部模型可以提供理想結(jié)果，這種情況通常在工藝開發(fā)周期中發(fā)現(xiàn)。

此外，證明了基于不同克隆的本地模型在使用簡化的過程數(shù)據(jù)集時具有很高的準確性。同時可以建立通用指南——例如，以標準操作程序 (SOP) 的形式，用于拉曼光譜 PAT 監(jiān)測。一旦落實到位，這些指南還可以用于開發(fā)方案，以適應(yīng)新的分子、工藝、產(chǎn)品模式，并為特定公司現(xiàn)有在使用 PAT（特別是拉曼光譜）的產(chǎn)品和平臺技術(shù)創(chuàng)建更通用的方法。

[1]Santos, Rafael M.Kaiser, PhilippMenezes, Jose C.Peinado, Antonio.Improving reliability of Raman spectroscopy for mAb production by upstream processes during bioprocess development stages[J].Talanta: The International Journal of Pure and Applied Analytical Chemistry, 2019, 199.