mRNA疫苗因其高效誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞反應(yīng)，在COVID大流行期間得到廣泛應(yīng)用。然而，疫苗接種后的不良反應(yīng)，如疲勞和發(fā)熱，成為公眾接受度的關(guān)鍵障礙。mRNA疫苗的免疫原性和反應(yīng)原性很大程度上取決于其脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)的性能。LNP不僅保護(hù)mRNA免受降解，促進(jìn)細(xì)胞攝取和胞質(zhì)遞送，還激活先天免疫系統(tǒng)，作為佐劑增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答，但同時(shí)也可能誘發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng)。

近日，日本大阪大學(xué)Yasuo Yoshioka團(tuán)隊(duì)在ACS NANO發(fā)表名為“Modulating Immunogenicity and Reactogenicity in mRNA-Lipid Nanoparticle Vaccines through Lipid Component Optimization"的研究。研究通過(guò)優(yōu)化LNP配方，以最小化反應(yīng)原性，同時(shí)維持強(qiáng)效的抗原特異性免疫應(yīng)答。

Figure 1. 示意圖

邁安納微流控XNano系列設(shè)備及試劑盒

Figure 2. Effect of chain length of PEG on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs.

不良反應(yīng)評(píng)估顯示，與PEG2k-LNP相比，PEG1k-LNP在注射后6小時(shí)誘導(dǎo)了更高水平的炎癥細(xì)胞因子（如IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6等）（圖3A）。這些結(jié)果提示，縮短PEG鏈長(zhǎng)雖然增強(qiáng)了免疫應(yīng)答，但也增加了疫苗的反應(yīng)原性。

Figure 3. Effect of chain length of PEG on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.

研究還評(píng)估了不同PEG脂質(zhì)摩爾比（0%、0.5%、1.5%）對(duì)mRNA-LNP疫苗體內(nèi)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射后6小時(shí)和24小時(shí)，不同PEG脂質(zhì)摩爾比的LNP在各組織中的FLuc活性無(wú)顯著差異（圖4B, C）。這表明PEG脂質(zhì)摩爾比的變化在短期內(nèi)對(duì)mRNA體內(nèi)表達(dá)的影響較小。

免疫應(yīng)答分析表明，降低PEG脂質(zhì)摩爾比顯著增強(qiáng)了抗原特異性免疫應(yīng)答。與1.5% PEG-LNP相比，0%和0.5% PEG-LNP在第二次免疫后誘導(dǎo)了更高的S蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖4D）。同時(shí)，0%和0.5% PEG-LNP還顯著增加了S蛋白特異性CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量（圖4F）。這些結(jié)果表明，降低PEG脂質(zhì)摩爾比能夠增強(qiáng)mRNA-LNP疫苗的免疫原性。

Figure 4. Effect of molar ratio of PEG-lipid on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs.

不良反應(yīng)評(píng)估顯示，與1.5% PEG-LNP相比，0%和0.5% PEG-LNP在注射后6小時(shí)誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低（圖5A）。值得注意的是，0% PEG-LNP雖然不誘導(dǎo)抗PEG抗體產(chǎn)生，但其顆粒穩(wěn)定性較差，這可能限制了其臨床應(yīng)用。

Figure 5. Effect of molar ratio of PEG-lipid on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.

研究評(píng)估了用植物甾醇（豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇）替代膽固醇對(duì)mRNA-LNP疫苗體內(nèi)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射后6小時(shí)和24小時(shí)，不同膽固醇類似物修飾的LNP在各組織中的FLuc活性無(wú)顯著差異（圖6B, C）。這表明膽固醇類似物的替代在短期內(nèi)對(duì)mRNA體內(nèi)表達(dá)的影響較小。

免疫應(yīng)答分析表明，膽固醇類似物替代誘導(dǎo)了與膽固醇LNP相似的抗原特異性免疫應(yīng)答。具體而言，豆甾醇-LNP和β-谷甾醇-LNP在第二次免疫后誘導(dǎo)了與膽固醇-LNP相當(dāng)?shù)腟蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖6D）。同時(shí)，這些膽固醇類似物-LNP也誘導(dǎo)了相似水平的S蛋白特異性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)（圖6F）。

Figure 6. Effect of replacement of cholesterol with naturally occurring cholesterol analogs on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs

不良反應(yīng)評(píng)估顯示，與膽固醇-LNP相比，豆甾醇-LNP和β-谷甾醇-LNP在注射后6小時(shí)誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低（圖7A）。同時(shí)，豆甾醇-LNP組小鼠的體溫升高也顯著減少（圖7B）。這些結(jié)果提示，膽固醇類似物的替代能夠降低mRNA-LNP疫苗的反應(yīng)原性。

Figure 7. Effect of replacement of cholesterol with naturally occurring cholesterol analogs on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.

研究評(píng)估了用DOPC或DOPE替代DSPC對(duì)mRNA-LNP疫苗體內(nèi)蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射后6小時(shí)，DOPC-LNP在引流淋巴結(jié)、脾臟和肝臟中的FLuc活性降低，而DOPE-LNP僅在引流淋巴結(jié)中的活性降低（圖8B）。在注射后24小時(shí)，DOPC-LNP在脛骨前肌、脾臟和肝臟中的FLuc活性也降低（圖8C）。這些結(jié)果表明，磷脂替代可能影響mRNA在體內(nèi)的分布和表達(dá)。

免疫應(yīng)答分析表明，磷脂替代誘導(dǎo)了與DSPC-LNP相似的抗原特異性免疫應(yīng)答。具體而言，DOPC-LNP和DOPE-LNP在第二次免疫后誘導(dǎo)了與DSPC-LNP相當(dāng)?shù)腟蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖8D）。同時(shí)，這些磷脂替代-LNP也誘導(dǎo)了相似水平的S蛋白特異性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)（圖8F）。這些結(jié)果表明，磷脂替代能夠在不顯著降低免疫原性的情況下進(jìn)行。

Figure 8. Effect of replacement of phospholipid on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs. (A-i) Chemical structures of DSPC, DOPC, and DOPE.

不良反應(yīng)評(píng)估顯示，與DSPC-LNP相比，DOPC-LNP和DOPE-LNP在注射后6小時(shí)誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低（圖9A）。同時(shí)，這些磷脂替代-LNP組小鼠的體溫升高也顯著減少（圖9B）。這些結(jié)果提示，磷脂替代能夠降低mRNA-LNP疫苗的反應(yīng)原性。

Figure 9. Effect of replacement of phospholipid on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.

蛋白表達(dá)與免疫反應(yīng)的正相關(guān)：分析顯示，脾臟中的FLuc（熒光素酶）表達(dá)水平與S特異性IgG抗體的產(chǎn)生、S特異性CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)之間存在顯著的正相關(guān)。這意味著，當(dāng)mRNA-LNP在脾臟中表達(dá)較高水平的蛋白時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)也更強(qiáng)。

蛋白表達(dá)與不良反應(yīng)的正相關(guān)：脾臟中的FLuc表達(dá)水平還與發(fā)熱反應(yīng)顯著正相關(guān)。

這表明，脾臟中較高的蛋白表達(dá)水平可能伴隨著更強(qiáng)的免疫激活，從而引發(fā)更明顯的發(fā)熱反應(yīng)。其他器官蛋白表達(dá)與免疫反應(yīng)和不良反應(yīng)的無(wú)顯著相關(guān)。

與脾臟不同，其他器官（如注射部位、引流淋巴結(jié)、肝臟）中的FLuc表達(dá)水平與S特異性IgG產(chǎn)生、S特異性CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)、發(fā)熱及體重變化之間無(wú)顯著相關(guān)性。

Figure 10. Correlation between in vivo protein expression and immune responses and adverse reactions.

本研究表明，通過(guò)調(diào)整PEG脂質(zhì)、膽固醇和磷脂的組成與結(jié)構(gòu)，可顯著影響mRNA-LNP疫苗的免疫原性與反應(yīng)原性。縮短PEG鏈長(zhǎng)度和降低PEG脂質(zhì)摩爾比，增強(qiáng)了免疫應(yīng)答，同時(shí)減少了不良反應(yīng)。這可能與PEG的立體阻礙效應(yīng)減弱有關(guān)，從而提高了免疫細(xì)胞的捕獲和內(nèi)化效率。植物甾醇和特定結(jié)構(gòu)的磷脂替代，亦能誘導(dǎo)相似的免疫應(yīng)答，同時(shí)降低不良反應(yīng)，這可能與它們的抗炎癥生物活性有關(guān)。值得注意的是，脾臟中的蛋白表達(dá)與免疫應(yīng)答和不良反應(yīng)密切相關(guān)。這可能是因?yàn)槠⑴K作為次級(jí)淋巴器官，富含抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，能夠高效捕獲和處理LNP遞送的抗原，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。同時(shí)，脾臟中的免疫細(xì)胞對(duì)LNP的識(shí)別也可能觸發(fā)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致不良反應(yīng)。

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參考文獻(xiàn)：Modulating Immunogenicity and Reactogenicity in mRNA-Lipid Nanoparticle Vaccines through Lipid Component Optimization.