mRNA 藥物LNP一步檢測(cè)新方法：BIA PATfix LNP 平臺(tái)

LNP-mRNA 包封率、mRNA 完整性、游離及包封的mRNA含量、LNP 粒徑大小及分布的 “一站式檢測(cè)"

導(dǎo)讀：

mRNA藥物的生產(chǎn)中，實(shí)際包封的mRNA含量，其中完整mRNA的比例，LNP的均一性，以及LNP 對(duì) mRNA 的包封率，直接決定 mRNA 疫苗的有效性與安全性，精準(zhǔn)分析以上數(shù)據(jù)成為 mRNA藥物研發(fā)與生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

一、傳統(tǒng)包封率檢測(cè)方法的技術(shù)瓶頸

當(dāng)前主流的熒光標(biāo)記法（如 RiboGreen 檢測(cè)），雖操作流程相對(duì)簡便，但在實(shí)際應(yīng)用中面臨諸多難以規(guī)避的技術(shù)缺陷，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性：

檢測(cè)干擾顯著：熒光染料易穿透 LNP 膜與包封 mRNA 結(jié)合，導(dǎo)致游離 mRNA 檢測(cè)值偏高（假陰性）；同時(shí) LNP 表面的 PEG 基團(tuán)可能阻礙染料與游離 mRNA 結(jié)合，造成游離 mRNA 檢測(cè)值偏低（假陽性），雙向干擾下包封率測(cè)算偏差可達(dá) 15%-20%。

樣品處理風(fēng)險(xiǎn)高：需使用裂解液破壞 LNP 以檢測(cè)總 mRNA 量，若裂解不充分，總 mRNA 釋放不（假陰性）；若裂解時(shí)間過長，mRNA 易降解（假陽性），且裂解操作對(duì)人員技術(shù)熟練度要求，不同操作者處理同一批樣品，結(jié)果差異可達(dá) 10% 以上。

功能參數(shù)缺失：僅能測(cè)算包封率，無法同步評(píng)估 mRNA 完整性（如降解程度）與 LNP 粒徑分布，而這兩項(xiàng)參數(shù)同樣影響疫苗穩(wěn)定性與遞送效率，需額外采用毛細(xì)管電泳（CE）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）等方法檢測(cè)，流程繁瑣且耗時(shí)。

二、BIA PATfix LNP 平臺(tái)：SDVB/OH 柱二元色譜法的創(chuàng)新解決方案

針對(duì)傳統(tǒng)方法的痛點(diǎn)，BIA Separations 推出的PATfix LNP 平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了 LNP-mRNA 包封率、mRNA 完整性、mRNA含量、LNP 粒徑分布的 “一站式檢測(cè)"，且無需復(fù)雜樣品預(yù)處理，操作流程已通過《Journal of Chromatography B》文獻(xiàn)驗(yàn)證（檢測(cè)限 LOD=15ng mRNA，定量限 LOQ=45ng mRNA，線性相關(guān)系數(shù) R2＞0.99）， GMP 級(jí)質(zhì)量控制要求。

1.二元色譜法核心原理：基于 “親疏水性差異" 的精準(zhǔn)分離

BIA 二元色譜系統(tǒng)的核心優(yōu)勢(shì)，在于利用 OH 柱與 SDVB 柱對(duì) LNP、游離 mRNA 的差異化結(jié)合能力，實(shí)現(xiàn)兩者高效分離，具體機(jī)制如下：

OH 柱的 “LNP 捕獲" 作用BIA CIMac® OH 柱（常用 0.1mL 規(guī)格，6μm 通道）為親水相互作用柱，其表面羥基可與 LNP 表面脂質(zhì)頭部的極性基團(tuán)形成氫鍵，同時(shí)在高離子強(qiáng)度平衡緩沖液條件下，柱配基呈現(xiàn)弱疏水特性，與 LNP 外層脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生疏水相互作用 —— 雙重作用下，LNP 被穩(wěn)定吸附在 OH 柱上；而游離 mRNA 因高度帶負(fù)電、疏水性弱，無法與 OH 柱結(jié)合，隨流動(dòng)相直接流穿，實(shí)現(xiàn) “LNP 與游離 mRNA 的初步分離"。

SDVB 柱的 “mRNA 解析" 作用經(jīng) OH 柱吸附的 LNP，用低離子強(qiáng)度洗脫緩沖液洗脫后，進(jìn)入 BIA CIMac® SDVB 柱（2μm 通道，柱溫 60℃）。SDVB 柱為強(qiáng)疏水柱，其表面疏水結(jié)構(gòu)可與 LNP 發(fā)生強(qiáng)相互作用，促使 LNP 解體釋放內(nèi)部包封的 mRNA；同時(shí)，mRNA 因堿基暴露具有一定疏水性，可與 SDVB 柱結(jié)合，而脂質(zhì)碎片隨流動(dòng)相流穿 —— 后續(xù)通過梯度提升乙腈濃度，mRNA 被洗脫，實(shí)現(xiàn) “包封 mRNA 的分離與定量"。

通過 OH 柱與 SDVB 柱的協(xié)同作用，游離 mRNA 與包封 mRNA 在色譜圖上呈現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立峰（游離 mRNA 峰出現(xiàn)在 8.8-10.4min，包封 mRNA 峰出現(xiàn)在 30.8-32.4min），無需染色或裂解，直接通過 UV-Vis 檢測(cè)器（260nm 波長）積分峰面積，即可按公式精準(zhǔn)計(jì)算包封率：

mRNA完整性測(cè)試

上圖：游離mRNA  下圖：LNP包封的mRNA

2.同步實(shí)現(xiàn) “多參數(shù)檢測(cè)"：超越傳統(tǒng)方法的附加值

BIA PATfix LNP 平臺(tái)不僅能精準(zhǔn)測(cè)算包封率，還可通過聯(lián)用檢測(cè)器同步獲取 mRNA 完整性與 LNP 粒徑分布數(shù)據(jù)，無需額外實(shí)驗(yàn)：

mRNA 完整性評(píng)估：SDVB 柱可根據(jù) mRNA 片段大小實(shí)現(xiàn)分離，通過 UV-Vis 色譜圖中 “完整 mRNA 峰與降解片段峰的面積占比"，直接計(jì)算 mRNA 降解率，避免傳統(tǒng) CE 檢測(cè)中樣品降解的風(fēng)險(xiǎn)。

LNP 粒徑分布檢測(cè)：OH 柱洗脫 LNP 時(shí)，聯(lián)用多角激光散射（MALS）檢測(cè)器（檢測(cè)角度涵蓋 28°-156°），通過 Berry 擬合模型計(jì)算 LNP 的旋轉(zhuǎn)半徑（Rg），進(jìn)而得到 hydrodynamic diameter（水力直徑），檢測(cè)結(jié)果與納米顆粒追蹤分析（NTA）一致性達(dá) 95% 以上，且可排除大顆粒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾（傳統(tǒng) DLS 易因大顆粒存在導(dǎo)致粒徑高估）。

三、二元色譜法實(shí)操優(yōu)勢(shì)：初學(xué)者友好，結(jié)果穩(wěn)定可重復(fù)

相比傳統(tǒng)方法，BIA SDVB/OH 柱二元色譜法在操作層面具有顯著優(yōu)勢(shì)，尤其適合初學(xué)者：

四、總結(jié)：BIA 二元色譜法 ——mRNA 疫苗包封率檢測(cè)的 “金標(biāo)準(zhǔn)"

在 mRNA 疫苗研發(fā)與生產(chǎn)中，包封率檢測(cè)的準(zhǔn)確性與效率直接影響項(xiàng)目進(jìn)度與產(chǎn)品質(zhì)量。BIA Separations 的 SDVB/OH 柱二元色譜法，通過 “無需預(yù)處理、多參數(shù)同步檢測(cè)、結(jié)果穩(wěn)定可重復(fù)" 的核心優(yōu)勢(shì)，解決了傳統(tǒng)方法的干擾多、風(fēng)險(xiǎn)高、流程繁等痛點(diǎn)，其性能已通過文獻(xiàn)驗(yàn)證與標(biāo)準(zhǔn)化 SOP 支持，不僅是實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段的高效工具，更可直接應(yīng)用于生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制（IPC）與成品檢驗(yàn)（QC）。

對(duì)于從事 mRNA-LNP 研究的科研人員與生產(chǎn)從業(yè)者而言，選擇 BIA PATfix LNP 平臺(tái)，意味著以更簡便的操作、更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)、更高效的流程，為 mRNA 疫苗的安全性與有效性筑牢質(zhì)量防線 —— 這正是新一代生物制藥檢測(cè)技術(shù)應(yīng)有的價(jià)值。

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