奧林巴斯熒光顯微鏡的解剖圖

2018/7/26 7:52:45 發(fā)布者：admin

與基于宏觀樣本特征的其他光學顯微鏡模式相比，例如相位梯度，光吸收和雙折射，熒光顯微鏡能夠僅基于熒光發(fā)射的特性來成像單個分子種類的分布。因此，使用熒光顯微鏡，可以監(jiān)測用特定熒光團標記的細胞內(nèi)組分的精確位置，以及它們相關的擴散系數(shù)，轉(zhuǎn)運特征和與其他生物分子的相互作用。此外，熒光對局部環(huán)境變量的顯著響應使得能夠研究活細胞和組織中的pH，粘度，折射率，離子濃度，膜電位和溶劑極性。

早的熒光顯微鏡配置采用經(jīng)典的明場或暗場透射（透射光）光學系統(tǒng)，將通過濾光器的激發(fā)光聚焦到樣品平面上。通過物鏡收集熒光發(fā)射以及大量的激發(fā)照射，并通過第二濾光器投射到目鏡光闌中以形成中間圖像。因為激發(fā)光的強度通常比熒光發(fā)射大幾個數(shù)量級，所以這些早期透射光顯微鏡中的樣本視圖通常對比度非常低并且疊加在充滿散射激發(fā)照射的背景上。使用高數(shù)值孔徑油浸暗場聚光器以高傾斜方位角照射樣品有助于消除大部分背景噪聲，但除了低數(shù)值孔徑物鏡外，沒有提供足夠的照明。產(chǎn)生的圖像分辨率差，亮度非常低。

熒光顯微鏡與入射光（反射光或落射）照明初是在20世紀20年代后期開發(fā)的，用于觀察不透明冶金樣品中的熒光發(fā)射。與他們的明場對應物一樣，這些反射光熒光儀器采用半反射式分束器，其總效率約為25％（每次通過鏡子后失去50％的照度）。然而，反射光熒光顯微鏡享有具有作為聚光器的高數(shù)值孔徑物鏡的優(yōu)點，并且能夠產(chǎn)生比在相似數(shù)值孔徑下操作的透射光顯微鏡具有顯著更高水平的圖像。此外，反射回物鏡（在高數(shù)值孔徑下）的雜散激發(fā)光減少到僅百分之幾。物鏡在反射光顯微鏡中的雙重作用也顯著簡化了對準任務。僅將物鏡聚焦到樣品上建立了照明場和視場，使得入射的激發(fā)光和觀察到的熒光發(fā)射遵循通過顯微鏡光學系列的相同路徑。

當在20世紀30年代中期開發(fā)出緊湊型汞蒸氣和氙弧放電燈時，照明光源的技術進步推動了反射光熒光（至少對于金相學）的轉(zhuǎn)變。在此期間，有色玻璃和明膠過濾器也變得更加復雜，這使得能夠使用鹵鎢燈應用由藍色和綠色可見光激發(fā)的熒光染料?？狗瓷渫繉雍透倪M的玻璃配方在20世紀40年代導致了物鏡設計的重大改進，但對入射光熒光顯微鏡發(fā)展的根本貢獻是引入了二色分光鏡（也稱為二向色鏡））由俄羅斯光學科學家Eugeny Brumberg于1948年開始。這項創(chuàng)新克服了在反射光顯微鏡中使用普通半反射鏡所固有的光損失問題。反射光熒光顯微鏡初由Johan S. Ploem在20世紀60年代后期廣泛商業(yè)化，他在開發(fā)Wild-Leitz Ploem Opak方面發(fā)揮了重要作用，其中包含多個可互換的光學模塊，并裝有各種熒光顯微鏡過濾器組合。

落射熒光顯微鏡的基本策略

反射光熒光顯微鏡絕大多數(shù)是用于非相干光源的寬場研究的當前選擇方法，以及用激光掃描共聚焦和多光子儀器進行的那些。這種流行的熒光顯微鏡模式也稱為入射光熒光，反射熒光或簡單的落射熒光。典型的現(xiàn)代反射光熒光顯微鏡，也配備了各種對比度增強模式下的透射光觀察，如圖1所示。顯微鏡包含一個三目觀察頭，耦合到電荷耦合器件（CCD））攝像系統(tǒng)，有兩個照明源，一個用于透射光，另一個用于觀察觀察（分別是鎢 - 鹵素和汞弧放電）。該設計的顯微鏡可以組合或交替反射光熒光與透射光相位對比度，微分干涉對比度（DIC），偏振光或霍夫曼調(diào)制對比度觀察。

任何熒光顯微鏡的基本特征是提供用于激發(fā)樣本的機制，其具有選擇性過濾的照明，然后使用第二過濾器分離更弱的熒光發(fā)射，以在暗的背景上以大的靈敏度形成圖像。在許多實驗中，生物樣本中的局部探針濃度非常低，只有一小部分激發(fā)光被熒光物質(zhì)吸收。此外，在那些能夠吸收一定量照射的熒光團中，發(fā)出二次熒光的百分比甚至更低。得到的熒光發(fā)射亮度水平將比照明的亮度水平低三到六個數(shù)量級。從而，熒光顯微鏡的基本問題是產(chǎn)生樣品的高效照明，同時捕獲與更強烈的照射帶有效分離的弱熒光發(fā)射。在現(xiàn)代熒光儀器中通過基于二色分束器的作用和特性協(xié)調(diào)激發(fā)和發(fā)射要求的濾光器的組合來滿足這些條件。

圖2概述了在反射光熒光顯微鏡中二色分束器（鏡子）功能背后的原理，其中包含熒光團的假想樣品，該熒光團在綠色區(qū)域（550納米）激發(fā)并發(fā)出紅色（620至660納米）波長的熒光。可見光譜。高強度光源以高通量密度（通常覆蓋大部分紫外線和整個可見光譜）輸出寬范圍的激發(fā)波長，這些波長穿過照明器并首先遇到選擇適當激發(fā)波段的濾波器（標記為EF; 見圖2（a））。在這種情況下，濾光器以高效率通過波長在510和560納米之間的光，但也允許其他波長以更小的程度通過。激發(fā)光接著到達二色鏡（圖2中的DM）并被反射到物鏡后孔中以形成照射樣品的錐形照明。雙色鏡位于光路中，呈45度角，設計用于選擇性地反射490和565納米之間的波長（如圖3所示），同時傳輸更短和更長的波長。

圖3中顯示了用于將激發(fā)光照與圖2中的熒光發(fā)射分開的濾光器組合的透射曲線。激發(fā)濾光片光譜（紅色曲線）在510和560納米之間顯示出高水平的透射率（大約80％）。中心波長（CWL）535納米。二色鏡（黃色曲線）反射激發(fā)光譜區(qū)域中的波長，同時以相對高的效率通過更高和更低的波長。注意，二色鏡像曲線上的百分比透射率對應于100％反射。在490和570納米之間的透射分布中的顯著下降（其表示反射率的峰值）用于反射從激發(fā)濾光器以90度角進入樣品的波長帶。光學系列中的后一個組件，即發(fā)射或屏障濾光器（白色曲線），透射高于590納米的波長，這對應于具有黃色，橙色和紅色的可見光。各種疊加光譜的透射和反射波段之間的邊界被設計成盡可能陡峭，以確保反射和透射波長幾乎*分離。在二色鏡光譜中出現(xiàn)正弦上升和下降尖峰的圖案是薄膜沉積過程的常見效果，稱為響個不停。該濾波器組合的性能非常出色，清楚地證明了薄膜干涉濾波器技術的快速發(fā)展。

因為只有窄帶寬的光被雙色鏡反射，所以設法通過激發(fā)濾光片的短于490納米且長于565納米的照射波長也通過二色鏡傳輸，如截止上方的光所示。在圖2（a）中。注意，激發(fā)光的反射不是100％有效，因此，少量綠光通過二色鏡而不被反射。另外，并非所有波長大于565或小于490納米的光都透過鏡子。這種光的一小部分被鏡子通過物鏡反射到樣品上。

由綠光激發(fā)產(chǎn)生的樣品的熒光發(fā)射（主要是紅色波長）由物鏡聚集并通過二色鏡和屏障濾光器（圖2（c）中截止的光線以上）。屏障過濾器（標記為BF在圖2中，專門設計為僅允許波長大于590納米的光到達顯微鏡目鏡和/或探測器。在用于此任務時，屏障濾光器有效地防止從樣本反射的（并且成功地穿過二色鏡）的激發(fā)光波長到達檢測器。然而，從樣品返回的大部分激發(fā)波長被二色鏡（圖2（c）中的截止光以下的光）反射到激發(fā)濾光器和發(fā)光器。圖2和3中所示的濾光器配置的凈效應是將強度明顯更高的激發(fā)光與更弱的熒光發(fā)射分開。在所有情況下，如圖所示，熒光顯微鏡中涉及的濾光片的截止水平不是的，但可以使波長范圍外的一些光線滲透。圖2（b）中以圖形方式顯示了整個事件序列，其中說明了有效反射光熒光顯微鏡所需的光學路徑和策略濾波器布置。

垂直熒光照明器

現(xiàn)代熒光顯微鏡的核心是通用反射光垂直照明器，它插在觀察觀察管和攜帶物鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器之間，如圖1和圖4所示。照明器設計用于引導高光產(chǎn)生的光 - 通過首先使光通過顯微鏡物鏡朝向樣品的方向，然后使用相同的物鏡捕獲樣品發(fā)出的光，將強度源置于樣品上。這種類型的照明策略具有幾個優(yōu)點。顯微鏡物鏡首先作為經(jīng)過良好校正的聚光器，然后收集成像熒光發(fā)射，以便傳輸?shù)侥跨R或相機檢測系統(tǒng)。因此，物鏡總是相對于每個功能正確對齊。此外，由樣本散射或反射的大部分激發(fā)光（在360度角上）遠離物鏡前透鏡元件，而不是直接投射到玻璃中，如透射熒光照射的情況。這種效應被稱為正面照明，特別適用于厚厚的標本。后，被照射的標本區(qū)域被限制在被觀察的相同區(qū)域，并且照明和光收集都可以利用物鏡的全數(shù)值孔徑。

在垂直照明器的遠端是燈箱（見圖4），其包含高強度電弧放電或燈絲基白熾燈光源。受歡迎的照明光源是高壓100瓦汞弧燈（HBO，通常稱為燃燒器）但是，氙氣和金屬鹵化物弧光燈，激光器和鹵化鎢白熾燈也可用于此目的。由光源發(fā)出的光由聚光透鏡系統(tǒng)聚焦，并沿著平行于桌面并垂直于顯微鏡光軸的照明器內(nèi)部行進。圖4所示的發(fā)光器設計包含多組件收集器透鏡系統(tǒng)，但也實施非球面透鏡元件以改善近紅外和紫外區(qū)域中的色差校正。設計用于去除或抑制紅外波長的熱過濾器放置在燈箱本身內(nèi)部或鄰近垂直照明器后部的燈箱安裝座。此外，一些顯微鏡包含雙頻或多頻激勵平衡器燈箱附近的系統(tǒng)（見圖4和圖8）選擇性地過濾激勵不需要的波長，以微調(diào)包含在照明器另一端的熒光濾光器組的性能。

同樣位于垂直照明器中燈箱附近的是一組中性密度濾光片，可用于調(diào)節(jié)通過系統(tǒng)的光的總強度并減少熒光褪色或光漂白。這些過濾器通常安裝在滑塊框架上，使其能夠在觀察樣品熒光的同時快速插入光路并從光路中移除。為了建立Köhler照明，垂直照明器包含一個可居中的光圈和視場光闌組合，兩者都有可變的光圈孔徑，決定了場的大小和照明強度。通過位于垂直照明器殼體的每個外側(cè)上的幾對旋鈕實現(xiàn)孔徑和場光闌的對中以及光圈尺寸的調(diào)節(jié)。在某些設計中，提供一個滑塊旋鈕，從光路中移除整個光圈組件，以大化通過照明器的光量。其他顯微鏡包含固定尺寸的針孔，安裝在滑塊上，可插入光路，大大限制照明場，適用于特殊應用，如光漂白后的熒光恢復（FRAP）調(diào)查。

在垂直照明器光學系列中的場光闌和光闌之后是場透鏡，它是擴散光并產(chǎn)生足夠的照明場以建立科勒照明所必需的。在場鏡之后，所有現(xiàn)代垂直照明器都包含一個光閘（具有手動開關控制），當沒有觀察或記錄熒光時，它阻止強烈的激發(fā)光到達濾光片組和樣品?？扉T是熒光顯微鏡的一個關鍵特征，因為樣品的連續(xù)照射可以顯著減少由于光漂白引起的發(fā)射，而高強度光對于活細胞是不健康的。此外，快門使電弧放電燈保持活動狀態(tài)（減輕預熱時間），同時用透射光瞬間檢查標本。熒光顯微鏡通常配備電子快門，可快速遠程控制照明。防紫外線護罩（標有圖4中的呼吸遮光罩安裝在照明器外殼的前部，以保護操作員在快門打開時不會意外泄漏潛在危險的短波紫外線輻射。通過在觀察時保護標本免受呼出氣體，護罩起到雙重作用。

幾種垂直照明器設計提供了用于矩形偏振器框架的槽，其可用于熒光偏振研究。在大多數(shù)情況下，將偏振器插入場鏡后面的照明光路（遠離共軛平面），但是在光閘之前（見圖4）。偏振器可以用預定的透射方位固定到位，或者安裝在齒輪組上，允許通過使用指輪改變透射軸的方向。由于偏振器安裝在滑動框架中，因此在不使用時可以很容易地從光路中移除。隨附的分析儀（熒光各向異性測量所需的第二個偏振器）可以安裝在濾光塊轉(zhuǎn)塔上方的垂直照明器中，或在專門設計的偏光顯微鏡中間管中。輔助管通常能夠插入漸變的旋轉(zhuǎn)偏振器單元，以確保分析器透射方位相對于偏振器和顯微鏡光軸的精確定位。

垂直照明器的后一級包含一個旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)臺或滑動支架，其中裝有包含熒光濾光器組合的光學塊。當需要使用特定熒光濾光器組合成像時，濾光器塊旋轉(zhuǎn)（或滑動）到光學系列中。單個塊包含一組匹配的激發(fā)和發(fā)射濾光片，以及二色分光鏡，所有這些都經(jīng)過精心定位，以大限度地提高樣品照射和捕獲特定波長的熒光發(fā)射。光學塊轉(zhuǎn)塔和滑塊支架可以裝載三到六個單獨的塊，其中一個位于光路中，而其他塊在臨時存儲中旋轉(zhuǎn)或滑出。當觀察用兩個或更多熒光探針標記的樣本時，這些附件能夠在熒光濾光片組之間快速轉(zhuǎn)換。在配備有熒光照明器的顯微鏡中使用透射照明通過裝配在轉(zhuǎn)臺或滑塊支架上的槽中的虛擬光學塊來促進。虛擬塊阻止激發(fā)發(fā)射（當快門打開時），但不包含任何濾光器并允許光從物鏡不受阻礙地通過觀察管。

在標準模塊化直立顯微鏡中，垂直照明器位于顯微鏡框架和觀察管之間（見圖1）。許多制造商提供可插入照明器和目鏡單元之間的中間管，用于偏振器，DIC棱鏡或其他附件?，F(xiàn)代顯微鏡框架通常是計算機輔助設計努力的結(jié)果，其導致顯著的減振和增強的人體工程學特征。合成材料，如金屬基陶瓷和鋁復合材料，可顯著提高框架的靜態(tài)和熱剛性，從而使儀器能夠承受先進熒光技術的嚴苛要求，這些技術需要在長時間內(nèi)*消除振動用于成像弱熒光發(fā)射。

Köhler熒光顯微鏡照明

在熒光垂直照明器中，光源被定位成使得細絲或電弧放電等離子體球位于聚光透鏡的主焦點附近。在Köhler照明中，燈聚光透鏡起到顯著增大的輔助光源的作用，以增強整體照明。Köhler照明的主要要求之一是燈絲或電弧的圖像必須終投射到物鏡的后焦平面上，在反射光照射的激發(fā)期間，它也是（通常是高數(shù)值孔徑）聚光器的兩倍。理想情況下，光源應填充整個物鏡孔徑，以大化輻射強度并產(chǎn)生均勻照射的場。在某些情況下，熱點）。但是，由于擴散濾光片也會降低照度，因此應盡可能避免使用。

在反射光Köhler照明（圖5中示意性地示出）中，光源的圖像被聚光透鏡聚焦到位于垂直照明器中的孔徑光闌膜片上。該光闌與物鏡的后孔和燈弧或燈絲共用共軛平面，因此確定照射的場孔徑尺寸。光源，垂直照明器孔徑光闌和物鏡后焦平面（光瞳）一起形成共軛平面的照明組。與透射光顯微鏡的情況不同，孔徑光圈和光源被成像到物鏡（充當聚光器）后孔徑平面上，而不是物理地位于該位置。作為此配置的附加好處，當物鏡提供激發(fā)照射或由聚集的熒光發(fā)射形成圖像時，所有障礙物（例如虹膜光圈）都從光路中移除。打開或關閉孔徑光闌用于控制雜散光并調(diào)節(jié)照明的強度（數(shù)值孔徑）而不改變照明場的大小。在圖像中，孔徑光闌的調(diào)整會影響亮度和對比度。

反射光Köhler照明中的共軛平面的成像或場組由場光闌，樣品表面和中間圖像平面組成。因此，當場光闌在樣品平面處聚焦時，光源的圖像顯著地從焦點移除，以便提供均勻的照明場。視場光闌控制照射場的大小而不影響被觀察區(qū)域的照明強度。在實踐中，場光闌開口尺寸應該盡可能小，以便增加圖像對比度并減少未被直接觀察的區(qū)域中的光漂白程度。盡管大多數(shù)電弧放電和燈絲光源產(chǎn)生的照明強度不均勻，但Köhler照明可以均勻照射樣品場。正確配置顯微鏡后，物鏡的后焦平面*照亮，從邊緣到邊緣提供均勻明亮的區(qū)域。在理想情況下，Köhler照明用一組會聚的波前對樣本進行沐浴，每個波前都是由光源上的單獨點形成的，這些點被成像到聚光器孔徑中。在正確配置的熒光顯微鏡中，結(jié)果是的圖像對比度和分辨率。在理想情況下，用一組會聚的波前對樣本進行沐浴，每個波前都是由成像到聚光器孔徑的光源上的不同點產(chǎn)生的。在正確配置的熒光顯微鏡中，結(jié)果是的圖像對比度和分辨率。在理想情況下，用一組會聚的波前對樣本進行沐浴，每個波前都是由成像到聚光鏡孔徑的光源上的不同點產(chǎn)生的。在正確配置的熒光顯微鏡中，結(jié)果是的圖像對比度和分辨率。

光源和燈塔

對于熒光顯微鏡中的嚴格定量分析，樣品照射必須在整個視野中在時間上和空間上恒定。隨時間的不穩(wěn)定性通常反映由于電源輸出變化而發(fā)生的燈輻射的波動。相反，在弧光燈中常出現(xiàn)的空間擾動來自稱為閃爍的現(xiàn)象因為等離子體球在電極上來回移動。閃爍通常由電源波動，電極電阻的小變化或機械振動產(chǎn)生。基于燈絲的光源，例如流行的鹵化鎢燈，在使用穩(wěn)壓電源的恒定直流電下工作時非常穩(wěn)定。通常，光源應選自其光譜含量，與物鏡后孔徑區(qū)域相比的燈絲尺寸，空間和時間穩(wěn)定性以及場照明的均勻性。還必須特別注意光源的強度，因為激發(fā)濾光器通過的窄帶波長僅包括總發(fā)光器輸出的非常小的部分。

選擇用于熒光顯微鏡的光源的主要考慮因素是與所研究的熒光染料的量子產(chǎn)率和吸收相關的紫外和可見光光譜分布。此外，光源必須與捕獲圖像所用探測器的靈敏度兼容，無論是人眼，傳統(tǒng)膠片，光電倍增管，增強型視頻管還是數(shù)碼相機系統(tǒng)。選擇還取決于照明模式。使用電弧放電或鎢 - 鹵素源滿足寬場熒光顯微鏡要求，而共聚焦和多光子顯微鏡需要適應各種激光系統(tǒng)。鎢和鎢 - 鹵素白熾燈的使用取得了有限的成功，因為它們的大部分發(fā)射發(fā)生在光譜的紅色和紅外區(qū)域，而大多數(shù)熒光團被紫外，藍色和綠色波長激發(fā)。此外，電弧放電燈的光輸出比通常用于透射光照射的12伏石英鹵素燈亮10到100倍。寬視場熒光顯微鏡受歡迎的光源是水銀弧光燈，它通常包含在基本模型顯微鏡配置中。在某些情況下，使用氙和金屬鹵化物弧光燈，但這些通常局限于光譜和強度分布與特定熒光團要求相匹配的特殊情況。

汞和氙燈的設計類似，除了燈泡外殼中的物理尺寸和氣體。汞燈包含兩個在高壓下密封在石英玻璃燈泡中的電極，該燈泡還含有汽化的元素汞。當電源通電時，一系列高壓脈沖被發(fā)送到電極，電離一小部分汞氣，點燃燈。在燒制之后，電壓降低并且電離氣體用于承載電流并產(chǎn)生在兩個電極之間形成的等離子體球。在燈工作期間，汞的蒸發(fā)在玻璃燈泡內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量和壓力，終產(chǎn)生高強度的光。汞弧燈產(chǎn)生的光線即使在紫外線和可見光譜范圍內(nèi)連續(xù)，集中在365,400,440,546和580納米的離散波長。從紫外線到紅外線，氙燈在整個光譜范圍內(nèi)具有更均勻的強度分布。熒光染料的選擇對于確定熒光顯微鏡的適當光源至關重要。一些熒光探針具有與突出的水銀線重合的激發(fā)帶，而其他熒光探針受益于氙燈的更均勻分布的照射。

熒光顯微鏡中弧光燈的正確對準對于實現(xiàn)科勒照明并避免熒光圖像中的明暗區(qū)域至關重要。因此，燈箱的質(zhì)量通?？梢酝ㄟ^正確的燈對準的穩(wěn)定性和用于保持對準的調(diào)節(jié)旋鈕的效率來判斷。燈座應配備燈對中螺釘，以使弧形圖像在物鏡后孔中居中，并且燈箱應包含紅外濾光器，以阻擋遠紅色和紅外線中的長波長，從而產(chǎn)生大量的熱量。一些燈箱設計有一個內(nèi)置的紅色抑制濾波器（例如，Schott BG38），或者用于這種過濾器的槽，以消除在某些應用中通過視野看到的帶紅色背景。此外，燈箱本身不應泄漏有害的紫外波長，并且優(yōu)選地，如果在操作期間無意中打開殼體，則應該包括開關以自動關閉燈。后，燈箱應足夠堅固，以承受運行期間可能的燃燒器爆炸。

熒光顯微鏡應用的廣泛多樣性通常需要一系列光源以滿足特定熒光團和成像條件的要求。在一些情況下，與超靈敏相機系統(tǒng)組合可能需要非常低的輻射，而對于其他研究，可能需要強激光激發(fā)以殺死活細胞或選擇性地漂白熒光團。波長要求通?？缭焦庾V的整個可見區(qū)域，以及紫外線和紅外線的部分。由于單個光源無法滿足這些多種照明要求，因此制造商現(xiàn)在提供的適配器可以將兩個或多個燈同時連接到單個顯微鏡上。

熒光濾光片組合

如前所述，穿過垂直照明器的透鏡和光闌的光終遇到容納在光學塊中的激發(fā)濾光器，該光學塊定位成與照明器光路和顯微鏡光學系統(tǒng)之間的軸向交叉點重合。激發(fā)濾光器從燈產(chǎn)生的寬光譜中選擇一個窄帶波長，并將它們傳遞到二色鏡，而二色鏡又將光反射通過物鏡并照射到樣品上。在固定目鏡光闌中形成圖像之前，由物鏡聚集的熒光發(fā)射再次通過二色鏡和發(fā)射或屏障濾光器。用于在寬場熒光顯微鏡中分離波段的常用濾波器包括彩色玻璃濾光片和干涉薄膜濾光片（或兩者的組合）。為熒光顯微鏡照明和成像方案中的每個步驟確定合適的過濾器可能會造成混淆，因為涉及大量過濾器制造商，每個過濾器制造商都為熒光文獻提供了專有的字母數(shù)字命名法。

圖7中示意性地示出了典型熒光激發(fā)塊的解剖結(jié)構(gòu)，以及二色鏡，激發(fā)和屏障濾光器的相關光譜輪廓。過濾塊通常由制造商提供的定制工具組裝，因此操作員可以互換過濾器和二色鏡。激發(fā)和屏障過濾器通過固定夾，光學膠或圓形螺紋安裝座固定到位（參見圖7）。通常，可以在不打開光學塊的情況下移除這些濾光器，因為它們位于平坦外表面上的凹陷孔上方。更換二色鏡更加困難，需要*拆卸塊才能進入內(nèi)部。大多數(shù)砌塊部分采用45度對角接頭鑄造，通過保護內(nèi)部并以適當?shù)慕嵌戎味R，可實現(xiàn)雙重任務。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后，可以通過松開或移動固定夾來取下鏡子，然后小心地將其從塊體中取出。應小心處理二色鏡，因為干涉涂層通常不受保護且容易劃傷。供應顯微鏡公司的幾家過濾器制造商也提供各種售后過濾器和二色鏡，適用于各種熒光應用。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后，可以通過松開或移動固定夾來取下鏡子，然后小心地將其從塊體中取出。應小心處理二色鏡，因為干涉涂層通常不受保護且容易劃傷。供應顯微鏡公司的幾家過濾器制造商也提供各種售后過濾器和二色鏡，適用于各種熒光應用。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后，可以通過松開或移動固定夾來取下鏡子，然后小心地將其從塊體中取出。應小心處理二色鏡，因為干涉涂層通常不受保護且容易劃傷。供應顯微鏡公司的幾家過濾器制造商也提供各種售后過濾器和二色鏡，適用于各種熒光應用。

熒光濾光片設計包括長通，短通（邊緣濾光片），以及窄帶，中帶和寬帶帶濾光片系列。圖7中示出的光譜示出了幾種常見濾波器輪廓的示例。圖7中的發(fā)射濾波器光譜（藍色曲線）由具有約575納米的截止波長的長通干涉濾波器產(chǎn)生。較長的波長通過濾波器傳輸，而較短的波長被阻擋。來自同一組的窄帶通激發(fā)濾波器（紅色曲線，圖7）具有約20納米的帶寬，而二色鏡（綠色曲線）具有近似中等（455-490納米）的透射區(qū)域和寬帶通濾波器（560） -775納米）。因為二色鏡有效地用作綠色中的長通濾波器，可見光譜的黃色和紅色區(qū)域（560至700納米），在濾光片組中對其進行處理。關于如何利用熒光團吸收和發(fā)射光譜分布來選擇合適的熒光顯微鏡濾光片組的工作知識對于成功實施該技術是*的。

二色鏡（或分束鏡）是熒光顯微鏡濾光器組合中關鍵的部件，類似于長通干涉型濾光器，其制造為具有多層介電材料的公差。二色鏡和標準干涉濾光器之間的主要區(qū)別在于，鏡子專門設計用于在限定的邊界波長下進行反射和透射，并且必須相對于顯微鏡和發(fā)光器光軸以45度角操作。將二色鏡定位成使干涉涂層面向激發(fā)光源，以便通過光學系統(tǒng)以90度角反射短的激發(fā)波長到樣品。同一鏡子也必須充當透射濾光器，以將長波長熒光發(fā)射從物鏡傳遞到像平面。因為幾乎全反射和大透射之間的波長過渡區(qū)域通常僅限于20或30納米，所以二色鏡能夠精確地區(qū)分激發(fā)和發(fā)射波長。

設計熒光濾光器組使得特定激發(fā)波長帶與二色鏡中的反射區(qū)域精確匹配。結(jié)果是激發(fā)光通過顯微鏡有效地反射到樣品上。樣品的熒光發(fā)射必須與二色鏡中的高透射區(qū)域匹配，以使這些波長能夠通過檢測器。屏障濾光器在整個方案中不太重要，但仍然在確保消除散射和反射的激發(fā)波長，來自靶以外的探針的熒光和由于自發(fā)熒光引起的一般背景強度方面起重要作用。創(chuàng)建濾波器組的重要因素是確保傳輸，反射，所涉濾波器的發(fā)射曲線與相應區(qū)域的發(fā)射曲線相匹配。否則，激發(fā)波長可能能夠通過二色鏡并使圖像模糊，或者熒光發(fā)射可能無意中在鏡子處反射以損害圖像亮度。

即使在看似完美匹配的濾波器組合中，也可能發(fā)生各個濾波器的光譜分布之間的輕微重疊，從而降低性能。特別值得關注的是激發(fā)濾光器和二色鏡之間的串擾，這使得一些激發(fā)光能夠通過鏡子并從濾光器塊的壁反射。如上所述，以高傾斜角度反射的光可以部分地透過屏障濾光器，以降低圖像對比度。這種通過過濾器的泄漏稱為滲透或交叉實際上所有濾波器組合都或多或少地發(fā)生。過濾器制造商和顯微鏡公司關注的主要領域之一是改進熒光濾光器組合的設計，以降低交叉水平。

熒光濾光片組的幾種配置如圖8所示。濾光片塊轉(zhuǎn)塔（圖8（a））包含五個塊，可以在濾光片組合之間快速轉(zhuǎn)換，同時研究至少這一數(shù)量的熒光團。其中一個轉(zhuǎn)塔槽通常填充有虛擬光學塊或留空以用于透射光觀察。使用激勵平衡器（圖8（b））微調(diào)激發(fā)光譜以成像雙重或多重標記的樣品，其中包含安裝在旋轉(zhuǎn)接頭上的單個干涉濾光片。旋轉(zhuǎn)激勵平衡器的調(diào)節(jié)桿使濾光器的帶通透射區(qū)域移動到更短的波長。從而，當平衡器濾光器從零度入射角（垂直于垂直照明器軸）旋轉(zhuǎn)到大旋轉(zhuǎn)角度45度時，濾光器的帶通區(qū)域可以移動25到50納米之間的值。激發(fā)平衡器可以單獨使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強度相等。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團強度，例如，減少來自一個探針的熒光發(fā)射，同時增加另一個探針的強度。激發(fā)平衡器可以單獨使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強度相等。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團強度，例如，減少來自一個探針的熒光發(fā)射，同時增加另一個探針的強度。激發(fā)平衡器可以單獨使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強度相等。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團強度，例如，減少來自一個探針的熒光發(fā)射，同時增加另一個探針的強度。

薄膜涂層技術的快速發(fā)展可以通過在單個干涉濾光器中產(chǎn)生多個透射峰值以及在二色鏡中制造交錯的反射和透射帶的能力來證明。當適當匹配時，可以組合兩個多波段濾光片和二色鏡，以產(chǎn)生多個熒光濾光片組，其能夠同時激發(fā)和觀察幾個熒光團的發(fā)射。過濾器組可從制造商處獲得，適用于同一樣品中的兩個，三個甚至四個熒光團。多個濾波器組的主要問題是它們的費用以及當來自一個熒光探針的發(fā)射通過用于另一個的帶通區(qū)域時發(fā)生的過量的交叉或滲透。在一些樣本（和濾鏡組）中，滲透對背景強度和圖像對比度具有顯著影響。許多研究人員傾向于使用優(yōu)化的濾光片組分別對每個熒光團成像，隨后將圖像組合成復合物。

先進的熒光技術通常需要使用具有單個二色鏡的多個激發(fā)和發(fā)射濾光器。為了便于這些研究，許多熒光顯微鏡配備了電動濾光輪或滑塊，多包含六個單獨的濾光片（見圖8（c））。設計用于滑塊的顯微鏡或者在垂直照明器中包含用于插入滑塊的特殊槽，或者過濾器滑塊可以代替通常包含中性密度濾光器的滑塊。在一些顯微鏡設計中，垂直發(fā)光器也可以容納發(fā)射滑塊，或者安裝在發(fā)光器和觀察管之間的輔助中間管以容納滑塊。在直立和倒置顯微鏡中，包含激發(fā)濾光器的電動濾光器單元通常夾在中性密度濾光器和燈箱之間的垂直照明器光學通路中。同樣，電動發(fā)射濾光片單元在垂直顯微鏡設計中放置在垂直照明器和目鏡觀察管之間，但通常通過與用于倒置器械的檢測器相同的外部端口連接。激勵和發(fā)射滑塊和電動濾光輪對于使用單個雙色鏡的雙重和三重激勵應用非常有用。通過消除在觀察單個樣本時重新定位過濾塊的需要，這些附件使研究者能夠獲得圖像之間的準確配準。

熒光顯微鏡的物鏡

在所有形式的反射光顯微鏡（包括熒光）中，圖像強度是物鏡數(shù)值孔徑和放大率的函數(shù)。實際上，強度或亮度（定義為每單位面積和時間的光子通量）增加了數(shù)值孔徑的四次方，但是僅與放大率的平方成反比：

強度α（NA obj）4 / M 2

其中NA是物鏡數(shù)值孔徑和M.是放大倍數(shù)。從這種關系中可以明顯看出，亮的熒光圖像將由具有高數(shù)值孔徑和低放大率（例如0.75 / 20x）的物鏡聚集。例如，數(shù)值孔徑為1.4的60x計劃復消色差油浸物鏡理論上會產(chǎn)生比相同數(shù)值孔徑的100倍物鏡更亮的圖像，但需要考慮折衷。增加內(nèi)部透鏡元件的數(shù)量（與高數(shù)值孔徑物鏡一樣）會產(chǎn)生自發(fā)熒光和來自內(nèi)部透鏡表面的強度減少反射的相應增加。通常，制造商在其推薦的熒光顯微鏡物鏡中做出高校正因子和增加的光透射之間的折衷。

一般來說，高數(shù)值孔徑油（1.3至1.4）和水（1.2）浸入計劃螢石和平面復消色差物鏡由于其巨大的聚光能力而產(chǎn)生亮的熒光圖像。這些物鏡表現(xiàn)出優(yōu)異的色彩校正，因此能夠?qū)⒍喾N熒光發(fā)射波長聚焦在同一平面內(nèi)。復消色差和螢石物鏡的透光特性在低至約350納米時是*的，這是檢查在紫外區(qū)域中激發(fā)的熒光染料（例如DAPI，Hoechst，Alexa Fluor-350和AMC）的要求。盡管有許多內(nèi)部鏡頭，但這些物鏡是由具有抗反射涂層的低熒光玻璃制成，以大限度地減少背景熒光并產(chǎn)生非常高對比度的圖像。

專為特殊應用而設計的物鏡廣泛用于熒光顯微鏡。這一類包括高數(shù)值孔徑水浸，多次浸泡（油，水和甘油），以及具有石英透鏡元件的紫外物鏡。對于活細胞成像應用，需要具有校正環(huán)的長工作距離物鏡，以便通過厚（0.5-2毫米）培養(yǎng)瓶壁觀察樣品。通過具有非常長的焦距（工作距離）的物鏡促進厚的試樣深處的檢查，這些物鏡可以從幾個制造商處獲得，用于通過空氣或水覆蓋眼鏡成像。設計用于沒有蓋玻片的長工作距離水浸物鏡也具有Teflon前錐，因此可以將物鏡浸入水溶液中。對于在20至30毫米（包括約5毫米水）的工作距離下在水中的紫外激發(fā)（340納米）產(chǎn)生類似的物鏡。對于相對較低的放大倍率研究，建議使用具有*數(shù)值孔徑（0.75至0.95）的20倍水浸物鏡。雖然非常昂貴，但這些物鏡在熒光團濃度和/或量子產(chǎn)率微不足道的情況下產(chǎn)生極其明亮的圖像。

熒光顯微鏡配件

制造商不斷為其儀器生產(chǎn)有用的附加配件單元，以增加熒光顯微鏡中不斷增長的成像應用的可用選擇。例如，在一些顯微鏡上可以選擇矩形場光闌（見圖9），它可以限制被照射的樣品區(qū)域，以提高對比度并減少光漂白。模塊化現(xiàn)場光闌代替垂直照明器中的傳統(tǒng)光圈光闌（也是可拆卸模塊），設計用于匹配數(shù)字成像傳感器的縱橫比。矩形場停止提高了科勒照明的效率，降低了電子傳感器的信噪比。作為額外的好處，在反卷積研究中使用可編程掃描階段時，可以調(diào)整圖像矩形大小以與階段步長一致。針孔類似于矩形場光闌，可用于需要高度受限照明場的應用。

其他配件包括雙燈外殼適配器，可使兩個光源（如水銀和氙弧放電燈）同時連接到垂直照明器。適用于激發(fā)激光的照明器也可用于全內(nèi)反射熒光（TIRF），熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）等應用），比率成像和光漂白恢復實驗。此外，主要制造商提供的大多數(shù)研究級熒光顯微鏡很容易適應各自的激光掃描共聚焦配件。直立式顯微鏡通過三目觀察管接受共焦掃描單元，而倒置儀器可將光束掃描儀連接到顯微鏡框架的側(cè)面或后端口。插入垂直照明器和觀察管之間的雙端口可用于引入額外的光源或?qū)晒庖龑У蕉嘤谝粋€檢測器。大多數(shù)這些裝置都配有可選的C型安裝適配器或標準顯微鏡端口配件。

設計用于電生理學研究的熒光顯微鏡已變得非常復雜。許多都配備了專門的減震級，可以接受各種微操縱器配件，用于使用熒光，紅外差分干涉對比（IR-DIC）的實驗）和傳統(tǒng)的明場對比度增強成像技術。擺動物鏡轉(zhuǎn)盤可實現(xiàn)物鏡的快速無振動交換，以防止在對活細胞和組織成像時干擾標本或氣泡的侵入。使用新的高數(shù)值孔徑長工作距離2x和4x微距鏡頭（物鏡）可以在生物體中進行熒光宏觀觀察，這些鏡頭配備有專門的濾光片組合塊。此外，一些制造商還提供熒光垂直照明器和濾光片組作為其立體顯微鏡的附件。

垂直照明器有時可選擇1.25倍至1.5倍的放大系數(shù)作為選項，但由于引入空放大的固有問題，應盡可能避免使用輔助鏡頭進入熒光圖像。幾種模塊化垂直照明器設計包括用于連接包含在照明器上方的多個攝像機端口的分束器模塊以增加成像能力的裝置?？紤]到現(xiàn)在可用于熒光顯微鏡的各種電動附件，包括物鏡轉(zhuǎn)盤，聚光鏡，濾光輪和平臺，研究人員可以獲得比以往更復雜的成像技術。制造商在許多復雜熒光應用的配件設計中投入了大量精力，這些應用曾經(jīng)只能使用來自各種來源的*件構(gòu)建的顯微鏡。隨著熒光顯微鏡成為細胞生物學，神經(jīng)生理學和臨床領域越來越重要的工具

倒置熒光顯微鏡設計

類似版本的垂直熒光照明器可用于倒置（組織培養(yǎng)）顯微鏡支架。倒置支架還允許反射光熒光和透射光顯微鏡的各種對比度增強技術之間的組合或交替。研究級倒置顯微鏡具有多個（多六個）輸入/輸出端口，通常在框架的每一側(cè)有單個端口，以及后部的一個或兩個端口（上部和下部）和底部下方的底部端口顯微鏡 在某些型號中，可以從三個或更多端口同時獲得主圖像，而無需使用中繼鏡頭。這種連接水平使得可以使用多個光源，濾光輪和相機系統(tǒng)進行復雜的熒光分析。用于倒置顯微鏡的汞和氙燈罩可與標準的多元件或非球面聚光透鏡一起使用，以提高性能并減少紫外和紅外光譜區(qū)域的像差。此外，可以使用各種燈箱適配器來連接多個照明源，類似于可用于直立顯微鏡的附件。

圖10中顯示了現(xiàn)代倒置（組織培養(yǎng)）熒光顯微鏡的剖面示意圖，該顯微鏡配備有Peltier冷卻的CCD圖像傳感器和傳統(tǒng)的35毫米膠片相機系統(tǒng)。盡管膠片相機的用途有限，但大多數(shù)倒置顯微鏡仍然在前底座的下部包括用于這些附件的端口。圖10中所示的顯微鏡可以使用安裝在支柱上的鎢 - 鹵素燈箱來執(zhí)行傳統(tǒng)的明場透射照明（具有或不具有對比度增強）。汞或氙弧放電燈用于熒光顯微鏡，使用連接到特殊配置的后端口的反射光照明器?？讖胶蛨龉怅@，以及中性密度濾光片，在顯微鏡后部的端口附近進入。在一些倒置顯微鏡模型（未示出）中，包含可對中隔膜的L形反射光照明器可用于改善對后輔助端口的訪問以用于附加附件。圖10中通過顯微鏡的光路以黃色表示透射光，紫色表示未過濾弧光燈照明，綠色表示濾光熒光激發(fā)，紅光表示熒光發(fā)射。

現(xiàn)代倒置顯微鏡框架，如同它們的直立對應物，是由計算機設計和制造的復合材料，用于結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。此外，機械平臺部件和電路結(jié)構(gòu)設計具有短行程距離和高剛性，以避免在例如DIC棱鏡插入或物鏡校正環(huán)的調(diào)整等常規(guī)操作中操縱物鏡轉(zhuǎn)向器時的俯仰和偏航。先進的物鏡轉(zhuǎn)盤架階段能夠在延時和長時間的熒光觀察中實際消除焦點漂移。標準立式顯微鏡不具備的其他舞臺選項包括滑動和360度旋轉(zhuǎn)舞臺，玻璃舞臺插板，加熱板，培養(yǎng)皿和板支架以及二氧化碳培養(yǎng)箱。

具有模塊化設計的倒置顯微鏡可以容易地配置用于電生理學，體外受精，顯微操作，高分辨率DIC，視頻增強觀察和各種先進熒光技術的研究。這些儀器也很容易適用于共聚焦和多光子顯微鏡。電動配件包括百葉窗，濾光輪，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，熒光塊轉(zhuǎn)盤，聚焦驅(qū)動器和聚光鏡。當與高工作距離，水浸，紫外激發(fā)和相位對比的高級物鏡相結(jié)合時，所有都具有高度光學校正，倒置顯微鏡是進行活細胞和組織熒光研究的理想儀器。

結(jié)論

在熒光顯微鏡中，樣品內(nèi)局部熒光團濃度之間的廣泛變化，加上從一種熒光染料到另一種熒光染料的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的差異，顯著影響對于給定量的激發(fā)強度產(chǎn)生的發(fā)射信號。考慮到許多樣本在任何特定視場中僅包含微量的熒光材料，這些組合因子產(chǎn)生的平均熒光發(fā)射水平比激發(fā)強度小4到6個數(shù)量級。此外，還有一些更復雜的熒光技術，如原位雜交和共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），發(fā)射信號強度可以比激發(fā)的發(fā)射信號強度小9到10個數(shù)量級。為了補償激發(fā)強度和發(fā)射強度之間的這些大的差異，現(xiàn)代熒光顯微鏡必須能夠在不干擾熒光信號的情況下將激發(fā)照射衰減超過十億次。

熒光顯微鏡的主要特征之一是對特征波長吸收和發(fā)射光的熒光探針的高特異性，導致該技術能夠在復雜混合物中以非常低的濃度選擇性地檢測物鏡物種。此外，熒光的高靈敏度和空間分辨率使得能夠在顯微鏡的光學分辨率以下的長度尺度上精確定位和研究單個分子。局部環(huán)境因素也嚴重影響熒光發(fā)射，因此該方法是pH，粘度，離子濃度，分子距離和取向，膜電位，疏水性，電荷分布和擴散系數(shù)波動的理想探針。熒光的時間分辨率限于激發(fā)的熒光探針的壽命，其可以是納秒級。由于許多生物過程發(fā)生在這個時域，衰變動力學可以揭示有關細胞過程的動態(tài)信息。總的來說，這些因素在熒光顯微術應用于細胞生物學中至關重要。

在過去十年中，熒光顯微鏡以驚人的速度發(fā)展，同時在激光技術，固態(tài)探測器，干涉薄膜制造和基于計算機的圖像分析方面同樣迅速發(fā)展。高數(shù)值孔徑水浸物鏡的發(fā)展進一步有助于生物現(xiàn)象的研究，使研究人員能夠在其自然環(huán)境中深入探測活細胞。隨著顯微鏡制造商對研究界不斷變化的需求做出回應，先進的熒光儀器和配件的開發(fā)無疑將繼續(xù)發(fā)展，它們對探索自然神秘的終貢獻可能終具有深遠的意義。