會(huì)員.png)
10
當(dāng)前位置：美谷分子儀器（上海）有限公司>>技術(shù)文章>>酶標(biāo)儀長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)力學(xué)讀板模式助力微生物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)
酶標(biāo)儀長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)力學(xué)讀板模式助力微生物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)
動(dòng)力學(xué)讀板模式是酶標(biāo)儀除終點(diǎn)法之外最常用的檢測(cè)模式，用于測(cè)量樣品在一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生的變化，長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)測(cè)量可用于研究生物學(xué)的眾多方面，如酶動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)表達(dá)。
然而，在酶標(biāo)儀上運(yùn)行這樣一個(gè)長(zhǎng)期連續(xù)動(dòng)態(tài)讀取的實(shí)驗(yàn)需要占用酶標(biāo)儀很長(zhǎng)一段時(shí)間，大大降低了儀器的使用效率。此外，進(jìn)行一系列終點(diǎn)法讀取會(huì)產(chǎn)生一個(gè)一個(gè)的單獨(dú)數(shù)據(jù)，必須手動(dòng)將它們連接在一起才能生成動(dòng)力學(xué)曲線圖。使用 Molecular Devices 公司的酶標(biāo)儀和 SoftMax Pro 軟件，研究人員現(xiàn)在可以使用軟件的中斷和繼續(xù)讀板功能進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量 (圖 1) 。這些功能允許從儀器中移除微孔板進(jìn)行培養(yǎng)基添加或其他實(shí)驗(yàn)，然后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)讀數(shù)，同時(shí)將所有數(shù)據(jù)點(diǎn)保留在單個(gè)孔板中，以便于分析。
圖 1：非連續(xù)動(dòng)力學(xué)測(cè)量。動(dòng)態(tài)測(cè)量可以通過(guò)按下中斷按鈕。要繼續(xù)收集同一數(shù)據(jù)文件內(nèi)的動(dòng)力學(xué)測(cè)量值，可按下恢復(fù) (Append) 按鈕
這里向大家介紹如何使用非連續(xù)動(dòng)態(tài)讀取方式通過(guò) 600 nm 的吸光度進(jìn)行 24 小時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)量。在時(shí)間零點(diǎn)啟動(dòng)了動(dòng)力學(xué)讀板。要中斷動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在 SoftMax Pro 軟件的“控制與狀態(tài)"區(qū)域點(diǎn)擊“中斷"按鈕。儀器在暫停前完成了所選讀取區(qū)域中剩余孔的讀取。然后將板從酶標(biāo)儀中取出。對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀取的下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將孔板放入酶標(biāo)儀。打開(kāi)原始數(shù)據(jù)文件，點(diǎn)擊繼續(xù) (Append) 按鈕以恢復(fù)動(dòng)力學(xué)讀取并添加更多數(shù)據(jù)點(diǎn) (表 1) 。
表 1：酶標(biāo)儀設(shè)置用于細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)采集
繼續(xù) (Append) 功能將不連續(xù)的測(cè)量結(jié)果連接成一個(gè)連續(xù)的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。在 SoftMax Pro 軟件中計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的開(kāi)始時(shí)間，比較細(xì)菌生長(zhǎng)條件。設(shè)置數(shù)據(jù)歸一化，計(jì)算細(xì)菌培養(yǎng)達(dá)到 0.6 OD 值所需的起始時(shí)間，并計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)曲線拐點(diǎn)處的斜率 (表 2) 。
表 2：細(xì)菌生長(zhǎng)的不同參數(shù)。SoftMax Pro 軟件可用于分析細(xì)菌生長(zhǎng)的不同階段。軟件可計(jì)算出細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá) 0.6 OD 值所用時(shí)間
細(xì)菌培養(yǎng)會(huì)經(jīng)歷四個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期 (圖 2) 。本實(shí)驗(yàn)采集了足夠多的數(shù)據(jù)點(diǎn)，以生成三種不同細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 (圖 3) 。數(shù)據(jù)顯示，每種培養(yǎng)物在不同時(shí)間依次經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。圖中未觀察到衰退期，因?yàn)閮x器所采用的光散射法測(cè)量的是樣本的質(zhì)量而非單個(gè)細(xì)胞。死亡細(xì)胞仍占據(jù)樣本的質(zhì)量，并對(duì)光散射產(chǎn)生影響，從而影響 OD 600 值。
圖 2：細(xì)菌生長(zhǎng)階段。細(xì)菌生長(zhǎng)的四個(gè)不同階段
圖 3：細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。使用酶標(biāo)儀和 SoftMax Pro 軟件對(duì)三種不同稀釋度的細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)量。測(cè)量時(shí)長(zhǎng)為 24 小時(shí)?？梢钥闯觯幢銛?shù)據(jù)點(diǎn)之間的時(shí)間間隔較大，軟件仍能將它們連接起來(lái)
利用 SoftMax Pro 軟件可以計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)的各種參數(shù)。通過(guò)計(jì)算細(xì)菌培養(yǎng)物達(dá)到特定光密度時(shí)的時(shí)間，可以對(duì)生長(zhǎng)速率進(jìn)行定量比較。在本實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到在 10 倍稀釋的培養(yǎng)物中所需時(shí)間最短 (表 2) 。
檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的另一個(gè)用途是開(kāi)發(fā)和優(yōu)化檢測(cè)方法來(lái)篩選抗菌化合物，這是許多微生物和藥物開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室感興趣的方向。使用 SoftMax Pro 軟件中的工作流編輯器 (Workflow Editor) 功能記錄細(xì)胞密度和轉(zhuǎn)染的 GFP 信號(hào)隨時(shí)間變化的過(guò)程，并進(jìn)行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，例如將 GFP 信號(hào)歸一化為細(xì)胞密度，以及提取生長(zhǎng)速率或其他動(dòng)力學(xué)相關(guān)信息。
本實(shí)驗(yàn)使用含有質(zhì)粒 pMV158-GFP 的糞腸球菌菌株 OG1RF 在不同的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行研究。利用 SoftMax Pro 工作流程編輯器 (Workflow Editor) ，創(chuàng)建了一個(gè)包含吸光度讀數(shù)（OD600）和熒光讀數(shù)（GFP）的動(dòng)態(tài)循環(huán)，并在兩次讀數(shù)之間進(jìn)行 5 秒的孔板線性震蕩 (圖 4) 。在 600 nm 處測(cè)量吸光度（OD600），以確定細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。通過(guò)底部讀取熒光檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè) GFP 表達(dá)，作為存活情況的指標(biāo)，激發(fā)波長(zhǎng)為 485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 515 nm。兩條數(shù)據(jù)軌跡 (吸光度和熒光) 記錄在兩個(gè)獨(dú)立的孔板區(qū)域中。該動(dòng)態(tài)循環(huán)被設(shè)置為每 15 分鐘重復(fù)一次，總共持續(xù) 18 小時(shí)?？蛇x的軟件功能允許用戶暫停和恢復(fù)動(dòng)態(tài)讀取，從而在運(yùn)行過(guò)程中添加試劑。所得的雙重讀取模式動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)使用 SoftMax Pro 軟件進(jìn)行分析。
圖 4：SoftMax Pro 7 工作流編輯器雙讀取模式動(dòng)態(tài)檢測(cè)。拖放功能易于創(chuàng)建，并且可以快速設(shè)置自定義工作流
通過(guò)運(yùn)算設(shè)置界面可以進(jìn)行高級(jí)動(dòng)態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析。圖 5 展示了細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的運(yùn)算方法設(shè)置。菜單被分為兩個(gè)部分：原始數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)運(yùn)算步驟。
圖 5：運(yùn)算設(shè)置菜單中的數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)。此圖展示了對(duì)孔板截面 OD600nm 的光密度數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，然后用 5 個(gè) Vmax 點(diǎn)將其還原為 Vmax 速率值，以檢索曲線最陡的部分
原始數(shù)據(jù)跟蹤與轉(zhuǎn)換 (標(biāo)準(zhǔn)化) 數(shù)據(jù)跟蹤的比較視圖如圖6所示。
圖 6：GFP 信號(hào)歸一化到 OD600 的細(xì)胞密度
當(dāng)然，也可以將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并計(jì)算出最大生長(zhǎng)速率，如圖 7。
圖 7：原始和運(yùn)算后的數(shù)據(jù)視圖，對(duì) OD600 數(shù)據(jù)應(yīng)用對(duì)數(shù)運(yùn)算。以 A1 ~ A5 孔為例，分別進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)條件。上圖：OD600 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)軌跡的原始數(shù)據(jù) (藍(lán)線) 。下圖：使用對(duì)數(shù)縮放 (黑線) 轉(zhuǎn)換的原始數(shù)據(jù)，以及通過(guò)應(yīng)用 Vmax 數(shù)據(jù)運(yùn)算 (橙線) 確定指數(shù)階段的增長(zhǎng)率
為了讓用戶能夠以表格形式直觀地比較不同的生長(zhǎng)條件 (以數(shù)值形式呈現(xiàn)) ，模板編輯工具允許將板布局與樣本組進(jìn)行關(guān)聯(lián)，然后將運(yùn)算后的數(shù)據(jù) (最大增長(zhǎng)率) 以表格形式展示出來(lái)，如圖 8 (上圖) 所示。通過(guò)后續(xù)的計(jì)算步驟，可以得到生長(zhǎng)速率 (k) 和倍增時(shí)間 (g) 。為了更好地進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，結(jié)果可以以柱狀圖的形式展示 (圖 8，下圖) ，以便更輕松地評(píng)估生長(zhǎng)條件或處理效果。
圖 8：結(jié)果顯示選項(xiàng)。將糞腸桿菌運(yùn)算數(shù)據(jù)顯示及各實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)果 (第 1 列至第 5 列，n=8) 匯總在結(jié)果表中，并以柱狀圖表示。使用 Vmax 速率展示生長(zhǎng)速率 (k=Vmax*3600) 和倍增時(shí)間 (g=ln2/k)
綜上所述，在以 SpectraMax iD3s 為代表的多功能酶標(biāo)儀上，利用非連續(xù)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)模式和 SoftMax Pro 軟件的工作流編輯器 (Workflow Editor) 以及強(qiáng)大的數(shù)據(jù)計(jì)算能力，可以靈活地設(shè)計(jì)微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)過(guò)程，包括中途添加試劑或藥物，兩種或多種檢測(cè)功能按次序自動(dòng)運(yùn)行，無(wú)需借助第三方軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和曲線圖形繪制，幫助我們高效完成微生物相關(guān)研究。
SpectraMax iD3s 多功能微孔板讀板機(jī)
關(guān)于美谷分子儀器
Molecular Devices 始創(chuàng)于上世紀(jì) 80 年代美國(guó)硅谷，并在全球設(shè)有多個(gè)代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設(shè)立了中國(guó)代表處，2010 年加入全球科學(xué)與技術(shù)的創(chuàng)新者丹納赫集團(tuán)，2011 年正式成立商務(wù)公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續(xù)創(chuàng)新、快速高效、高性能的產(chǎn)品及完善的售后服務(wù)著稱(chēng)業(yè)內(nèi)，我們一直致力于為客戶提供在生命科學(xué)研究、制藥及生物治療開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域蛋白和細(xì)胞生物學(xué)的創(chuàng)新性生物分析解決方案。
