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共焦顯微鏡工作的基本原理
傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾。激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源，點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，zui終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，zui終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學(xué)橫切面，這個光學(xué)橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學(xué)薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進入檢測針孔。