Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts

Keywords: cellular senescence; mechanical stress; mechanosensitivity; nuclear integrity.

細(xì)胞衰老是一種細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，在發(fā)育和損傷后的組織形成和重塑中發(fā)揮作用。定義衰老的zui廣泛認(rèn)可的標(biāo)志物是通過細(xì)胞周期停滯信號，特別是小鼠的 p16/p19（或人類的 p16/p14）和 p53/p21。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，機(jī)械刺激和微環(huán)境的改變可能是啟動(dòng)早衰樣狀態(tài)的另一個(gè)因素。隨著在創(chuàng)傷和疾病中觀察到的長期暴露于物理應(yīng)力或拉伸應(yīng)變，細(xì)胞和細(xì)胞核會(huì)發(fā)生直接變化，從而影響一系列生物標(biāo)志物。然而，如果細(xì)胞應(yīng)力繼續(xù)超出正常生理范圍，則可能出現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的過早衰老表型。這種表型與癌癥、骨關(guān)節(jié)炎和心血管疾病等病理狀態(tài)有關(guān)。值得注意的是，這些疾病狀態(tài)通常會(huì)導(dǎo)致組織中生化和機(jī)械環(huán)境的變化，表明衰老可能是由多種因素共同引起的。

心臟成纖維細(xì)胞（CFs）是心臟組織中對環(huán)境信號參與適應(yīng)性反應(yīng)的主要細(xì)胞類型之一。研究表明， CF 的表型可塑性通過機(jī)械敏感反應(yīng)，在生物化學(xué)上由鈣信號介導(dǎo)，在生物物理上由α-SMA增加介導(dǎo)。此外，已知拉伸幅度和基質(zhì)剛度的改變會(huì)將 CFs 激活為肌成纖維細(xì)胞表型。衰老的心肌細(xì)胞由于細(xì)胞收縮力下降而導(dǎo)致收縮頻率增加，從而表現(xiàn)出收縮功能障礙。CFs 嵌套在心肌細(xì)胞之間，被動(dòng)地經(jīng)歷這種收縮功能障礙，表明心肌細(xì)胞和 CFs 之間存在連續(xù)串?dāng)_。

基于此，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校機(jī)械工程系及生物醫(yī)學(xué)工程項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)使用體外模型模擬心臟病中的機(jī)械破壞，旨在通過檢測細(xì)胞衰老標(biāo)志物以確定擾動(dòng)機(jī)械刺激是否可以在小鼠原代 CFs 中觸發(fā)應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰表型。由于核膜結(jié)構(gòu)完整性的改變和氧化應(yīng)激的增加與幾種類型的心血管疾病有關(guān)，還進(jìn)一步研究了氧化應(yīng)激和核纖層蛋白A/C 突變對 CFs 的衰老反應(yīng)。研究分析表明，早衰表型可以由機(jī)械環(huán)境中的擾動(dòng)單獨(dú)啟動(dòng)，與化學(xué)誘導(dǎo)相比是獨(dú)特的。研究成果發(fā)表于Advanced Science 期刊題為“Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts"。

首先，為了檢查擾動(dòng)機(jī)械刺激對心臟成纖維細(xì)胞（CFs）的作用，對小鼠原代野生型（WT）CFs進(jìn)行兩種循環(huán)拉伸模式持續(xù)4天（圖1 A）。第一種模式稱為對照拉伸（1 Hz，8.5%），第二種模式稱為損傷拉伸，它模仿了心臟病中觀察到的機(jī)械負(fù)荷變化，在1 Hz，8.5% 應(yīng)變持續(xù)24 小時(shí)，然后幅度降低到2.5% 應(yīng)變，頻率增加到2 Hz（圖1 B）。4天（96小時(shí)）后，使用標(biāo)記細(xì)胞周期 G1、G2 和 S 期細(xì)胞的 Ki-67，與對照拉伸 CFs 相比，損傷拉伸組 CFs 顯示 Ki-67 歸一化強(qiáng)度值顯著降低（圖1 C），這與增殖能力降低和細(xì)胞周期停滯一致，是衰老的標(biāo)志。

同時(shí)，評估了損傷拉伸組 CFs 的其他衰老特征，如核纖層蛋白B 的表達(dá)、核形態(tài)的改變、DNA 損傷和細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物的基因表達(dá)。在體內(nèi)和體外衰老細(xì)胞中觀察到核纖層蛋白 B 減少。此外，損傷拉伸組 CFs的核面積顯著增加，但沒有觀察到核長寬比的變化。γH2A.X 焦點(diǎn)的 DNA 損傷，是在應(yīng)激引起的早衰中常見的雙鏈斷裂（DSB）的標(biāo)志物。通過γH2A.X的存在測量DNA損傷，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，損傷拉伸CFs中每個(gè)細(xì)胞核的γH2A.X焦點(diǎn)顯著增加，這提供了一種觸發(fā)衰老狀態(tài)啟動(dòng)的信號機(jī)制。已知 p53-p21-RB 軸參與 DNA 損傷反應(yīng)信號和細(xì)胞周期停滯。RT-qPCR 結(jié)果顯示，損傷拉伸組 CFs 的 p53 和 p21 表達(dá)增加，但令人驚訝的是 p16 的表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)表明，通過細(xì)胞周期、核形態(tài)和 DNA 損傷的標(biāo)記進(jìn)行評估時(shí)，小鼠原代 CFs的機(jī)械擾動(dòng)會(huì)誘導(dǎo)衰老樣表型。

圖1     機(jī)械負(fù)荷的改變會(huì)破壞原代心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖。

考慮到定義衰老表型需要多種標(biāo)志物的組合，而且有幾種標(biāo)志物不是衰老du有的，研究人員試圖通過氧化應(yīng)激、活性氧（ROS）誘導(dǎo)的衰老來額外誘導(dǎo)衰老表型。使用*處理原代 WT CFs 超過 21 天，以化學(xué)誘導(dǎo)衰老。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。與組織培養(yǎng)板（TCP）對照相比，ROS誘導(dǎo)的CFs的Ki-67染色顯著減少，表明增殖減少。同時(shí)，ROS誘導(dǎo)的CFs 核纖層蛋白B 環(huán)厚度減少（圖2 A），強(qiáng)度普遍降低，核面積顯著增加（圖2 B）。通過γH2A.X焦點(diǎn)計(jì)數(shù)檢查了ROS誘導(dǎo)的衰老CFs是否增加DNA損傷，發(fā)現(xiàn)TCP和ROS誘導(dǎo)的CFs之間沒有差異（圖3 C）。p53 和 p21 的基因表達(dá)分析支持了 γH2A.X 焦點(diǎn)沒有顯著差異，與 TCP 對照相比，這兩個(gè)基因都有所減少（圖2 D）。與機(jī)械誘導(dǎo)的衰老CFs相似，p38基因表達(dá)沒有差異。然而，ROS 誘導(dǎo)的 CFs 顯示出 p16 表達(dá)的增加。

上述研究表明，機(jī)械誘導(dǎo)的衰老樣CFs表現(xiàn)出與ROS誘導(dǎo)的CFs相似的衰老特征，即增殖下降（即Ki-67），核纖層蛋白B減少，核面積增加。然而，兩種誘導(dǎo)模式可能有其獨(dú)特的途徑，且取決于機(jī)械刺激與生化刺激。雖然兩種處理都顯示出細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物的表達(dá)增加，但 ROS 誘導(dǎo)的 CFs 表現(xiàn)出顯著的 p16 上調(diào)，而機(jī)械誘導(dǎo)的 CFs 表現(xiàn)出 p53 和 p21 表達(dá)的增加。

圖2    氧化應(yīng)激下的心臟成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出化學(xué)誘導(dǎo)衰老表型標(biāo)志物，包括形態(tài)、DNA 損傷和基因表達(dá)的改變。

由于在衰老細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的許多改變和標(biāo)記與細(xì)胞核和核膜的變化重疊，實(shí)驗(yàn)假設(shè)核膜中的機(jī)械敏感蛋白可能會(huì)放大衰老樣表型的啟動(dòng)。因此，從4-9周齡的核纖層蛋白A/C缺失小鼠中建立了CFs的原代培養(yǎng)物，暴露于對照拉伸和損傷拉伸的加載條件下。結(jié)果觀察到，與對照拉伸 CF 相比，損傷拉伸 CF 中的 Ki-67 分布顯著降低（圖3 A），核面積或縱橫比沒有變化（圖3 B），核纖層蛋白B 環(huán)厚度增加（圖3 C），這可能是在核纖層蛋白 A/C 缺失情況下的一種代償機(jī)制。檢查 CFs 中的 DNA 損傷反應(yīng)，觀察到 γH2A.X 焦點(diǎn)增加（圖3 D），但基因表達(dá)分析未顯示 p53 或 p21 的顯著差異。雖然沒有觀察到核纖層蛋白 B 環(huán)厚度的減少，這將證實(shí)衰老樣表型，但實(shí)驗(yàn)注意到機(jī)械刺激（對照和損傷拉伸）下核纖層蛋白 A/C 缺失的 CFs 中核破裂和核纖層蛋白B 稀釋區(qū)域的增加，這表明沿核膜的核纖層蛋白 A/C 的缺失降低了結(jié)構(gòu)完整性。這表明，形態(tài)學(xué)讀數(shù)、基因表達(dá)和 DNA 損傷的總體變化并不表明過早衰老狀態(tài)的進(jìn)展是由于核纖層蛋白 A/C 的丟失而改變的核結(jié)構(gòu)完整性而放大的。

圖3     通過核纖層蛋白 A/C 丟失破壞核完整性不會(huì)放大心臟成纖維細(xì)胞中機(jī)械誘導(dǎo)的早衰表型。

由于上述過程沒有觀察到核纖層蛋白A/C 缺失的 CFs 的放大表型，最后，實(shí)驗(yàn)觀察了核膜中其他機(jī)械敏感的蛋白質(zhì)。Emerin 是一種核膜蛋白，與核纖層蛋白A/C 緊密相互作用，調(diào)節(jié)核的力學(xué)性質(zhì)和信號傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)變增加會(huì)導(dǎo)致 Emerin 定位到外核膜。使用相同的拉伸方案來啟動(dòng)機(jī)械誘導(dǎo)的衰老表型（圖1 B），發(fā)現(xiàn)與對照拉伸CFs 相比，損傷拉伸CFs 的 Emerin環(huán)厚度顯著降低（圖 4 A）。

這一發(fā)現(xiàn)是否適用于所有的衰老CFs，量化 ROS 誘導(dǎo)和 TCP 誘導(dǎo)的CFs 中的Emerin環(huán)厚度，并沒有發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)的衰老 CFs 的改變（圖 4 B）。在所有核纖層蛋白 A/C 缺失細(xì)胞中，無論是機(jī)械刺激還是化學(xué)刺激，都測量到Emerin環(huán)厚度的減少，但兩者未發(fā)現(xiàn)顯著差異。這并不奇怪，因?yàn)楹死w層蛋白 A/C 缺失 CFs 中的Emerin定位已被證明主要定位在細(xì)胞質(zhì)上。此外，隨著Emerin環(huán)厚度的減小，還定性地觀察到緊鄰核膜周圍的不規(guī)則肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)模式。這些結(jié)果表明，機(jī)械敏感蛋白 Emerin 會(huì)隨著損傷性拉伸而減少，Emerin定位是機(jī)械誘導(dǎo)衰老的一個(gè)顯著特征，突出了它作為核結(jié)構(gòu)完整性的機(jī)械敏感調(diào)節(jié)劑的作用及其與衰老表型誘導(dǎo)的相互作用。

圖4    機(jī)械敏感核膜蛋白 Emerin 可能是心臟成纖維細(xì)胞中啟動(dòng)機(jī)械誘導(dǎo)衰老表型的關(guān)鍵介質(zhì)。

總之，這項(xiàng)研究檢查了在心臟病的簡化體外模型中，擾動(dòng)的機(jī)械刺激如何觸發(fā)細(xì)胞衰老的啟動(dòng)。利用先前建立的細(xì)胞衰老標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)擾動(dòng)力刺激可以改變增殖、核纖層蛋白 B 表達(dá)、誘導(dǎo) DNA 損傷反應(yīng)以及 p21 和 p53 表達(dá)的增加，從而定義 CFs 中機(jī)械誘導(dǎo)的衰老特征。此外，還發(fā)現(xiàn) Emerin （一種核膜中的機(jī)械敏感蛋白質(zhì)）可能在起始階段參與其中。該研究證明了機(jī)械刺激的生理變化，更具體地說，應(yīng)變幅度的降低和頻率的增加如何引發(fā)細(xì)胞衰老，從而推進(jìn)了更精確定義細(xì)胞衰老的嘗試。

參考文獻(xiàn)：Schneider SE, Scott AK, Gallagher KM, Miller EY, Ghosh S, Neu CP. Mechanical Stress Triggers Premature Senescence in Cardiac Fibroblasts. Adv Sci (Weinh). 2025 Sep 26:e13314. doi: 10.1002/advs.202513314. Epub ahead of print. PMID: 40999893.

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