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　　化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單性使得它的應(yīng)用很簡(jiǎn)單并且*可以自動(dòng)化。但是它的靈敏度又是怎么樣的呢?化學(xué)發(fā)光有如下兩個(gè)內(nèi)在的優(yōu)勢(shì)：

　　1.絕大多數(shù)的樣品沒(méi)有“背景”信號(hào)，如它們自身不發(fā)光。

　　2.化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)不是一個(gè)比例測(cè)試，這是與熒光和吸收或比色測(cè)試不同的。在熒光測(cè)試中，具有小的Stokes Shift的熒光基團(tuán)非常難檢測(cè)。熒光很難從激發(fā)波長(zhǎng)中分辨出來(lái)。

　　另外一個(gè)問(wèn)題是，特別在樣品是渾濁的情況下有一部分雜光會(huì)進(jìn)入到檢測(cè)器。

　　在吸收光測(cè)試上，其靈敏度受到限制的根本因素是需要在兩個(gè)相對(duì)較強(qiáng)的信號(hào)之間去區(qū)分一個(gè)較小的差別。

　　需要注意的是檢測(cè)器對(duì)光譜的敏感性近可能接近化學(xué)發(fā)光的光譜，以得到zui大化的靈敏度。一般在自發(fā)光儀中的光電倍增管對(duì)藍(lán)光有*的反應(yīng)，對(duì)紅光的末端光譜不太敏感。固態(tài)檢測(cè)器對(duì)紅光有較好的反應(yīng)。

　　X光片廣泛用于記錄在尼龍膜、纖維素膜或PVDF膜上的化學(xué)發(fā)光印跡分析。但是我們需要牢記在心的是X光片僅能夠用于檢測(cè)紫外到藍(lán)光光譜范圍內(nèi)的光信號(hào)，雖然有一些特殊的光片對(duì)增強(qiáng)的綠光有敏感性。

　　液體樣品的檢測(cè)

　　有一些特定的詞來(lái)描繪化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：靈敏度、線(xiàn)性和動(dòng)態(tài)范圍。每一個(gè)詞的意義如下：

　　1.靈敏度指的是某種東西可靠檢測(cè)的zui低水平。“某種東西”是指在一個(gè)分析測(cè)試中的測(cè)試物。測(cè)試物是被標(biāo)記了一種可檢測(cè)的東西，如化學(xué)發(fā)光化合物或的一種酶。分析物也可以是一種通過(guò)與具有標(biāo)記的親合物有特異性結(jié)合反應(yīng)而檢測(cè)的物質(zhì)。所謂的可靠檢測(cè)指的是針對(duì)一個(gè)空白測(cè)試樣品，檢測(cè)器能夠重復(fù)感應(yīng)到zui低水平的信號(hào)，而這種信號(hào)是由所檢測(cè)物本身產(chǎn)生的。

　　2.線(xiàn)性描述的是信號(hào)與分析檢測(cè)物濃度范圍之間的關(guān)系。理想的比例因子是常數(shù);信號(hào)點(diǎn)與分析檢測(cè)物是一條直線(xiàn)關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以不是直線(xiàn)，如s形，仍是有用的。

　　3.動(dòng)態(tài)范圍指的是被檢測(cè)物濃度與信號(hào)單一模式的變換范圍。它定義的是分析的工作范圍。

　　你期望通過(guò)化學(xué)發(fā)光得到什么水平的靈敏度呢?答案不一定會(huì)滿(mǎn)足你的要求，“它是有條件的”。在很少情況下，檢測(cè)器的靈敏度或化學(xué)發(fā)光方法會(huì)是檢測(cè)的局限因素。現(xiàn)在的檢測(cè)器可以達(dá)到很高的靈敏度。大多數(shù)情況下，而是其它的一些因素顯示了分析檢測(cè)的靈敏度。zui通常的是生物成分(抗體、酶等)的非特異性結(jié)合到反應(yīng)容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印跡實(shí)驗(yàn)，核酸雜交和其它的酶聯(lián)結(jié)合實(shí)驗(yàn)都是受制于此因素。

　　管和微孔板

　　玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化學(xué)發(fā)光測(cè)試比較理想的材料。理想的是光能夠通過(guò)一個(gè)平面然后測(cè)試，以減少邊際效應(yīng)。曲面也可以使用，如圓柱型的測(cè)試管。用不同的測(cè)試管測(cè)試比較結(jié)果，這些管必須是統(tǒng)一生產(chǎn)的，才可以比較結(jié)果。

　　微孔板——從化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性的，即在各個(gè)方向上同等發(fā)射出來(lái)的。如果一個(gè)化學(xué)反應(yīng)是在透明的微孔板中的微孔中進(jìn)行，光不僅從垂直方向發(fā)散，還從水平方向發(fā)散出來(lái)。光很容易的通過(guò)各個(gè)孔之間的間隙和孔壁。光較強(qiáng)的孔就會(huì)干擾相鄰的孔。因此，化學(xué)發(fā)光測(cè)試一般不用透明微孔板。

　　不透明的微孔板和板條主要有兩種——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因?yàn)橛泄馕?，所以它的信?hào)會(huì)比白色板有很明顯的減弱(將近10倍)。因?yàn)樗械目资峭缺壤氖盏接绊?，所以不管他們的?qiáng)度，定量并沒(méi)有問(wèn)題。白色或黑色板的選擇，主要是基于預(yù)期檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱，白色板用于檢測(cè)較弱光的檢測(cè)，黑色板用于檢測(cè)強(qiáng)光的檢測(cè)。黑色板的另一優(yōu)點(diǎn)就是可以削弱非特異性結(jié)合所帶來(lái)的問(wèn)題。

　　此外，白色板并不是*同等不透明。為熒光設(shè)計(jì)的白板的白色素比用于化學(xué)發(fā)光的白板的要少的多。在熒光檢測(cè)時(shí)，每檢測(cè)一次，一般在針對(duì)一個(gè)孔，消除了相鄰孔之間的干擾。白色微孔板的好壞很容易檢測(cè)，只要在板的后面放上一只燈，然后看每個(gè)孔。如果穿過(guò)的燈光不僅僅是淡淡的，那么用于較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物的分析是會(huì)有一些問(wèn)題的。

　　固態(tài)檢測(cè)

　　光電二極管能夠感應(yīng)比光電倍增管所感應(yīng)的更強(qiáng)的光強(qiáng)度。對(duì)于那些需要測(cè)試高強(qiáng)度光的應(yīng)用，選擇這樣的檢測(cè)器比較好。然而，固態(tài)檢測(cè)器的暗電流比光電倍增管一般要高很多。解決這個(gè)問(wèn)題的方法之一是通過(guò)Peltier或者是其它的熱電制冷設(shè)備冷卻固態(tài)檢測(cè)器。在0～30攝氏度范圍內(nèi)，固態(tài)檢測(cè)器的暗電流隨溫度的降低會(huì)急劇下降。冷卻的檢測(cè)器能夠整合1到100秒范圍內(nèi)所檢測(cè)到光信號(hào)而不會(huì)被暗電流所覆蓋。

　　CCD和其它的固態(tài)檢測(cè)器擁有以下幾個(gè)內(nèi)在的優(yōu)點(diǎn)：

　　1、在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)，固態(tài)檢測(cè)器有一個(gè)較好的光譜響應(yīng)。發(fā)光反應(yīng)發(fā)出紅光，甚至近紅外光。

　　2、CCD影像系統(tǒng)可以對(duì)不同的目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)?；旧先魏我环N樣品或容器都可以適用，如微孔板，細(xì)菌測(cè)試管或細(xì)胞培養(yǎng)皿，電泳凝膠和印跡膜。

　　3、單個(gè)PMT系統(tǒng)在測(cè)讀之前必須對(duì)樣品位置進(jìn)行定位。樣品管重復(fù)多次帶到一個(gè)固定位置，然后重復(fù)測(cè)讀。微孔板PMT測(cè)讀儀依賴(lài)于微孔之間的標(biāo)準(zhǔn)間隔，能夠按照一個(gè)預(yù)算好的位置移動(dòng)微孔板，由此微孔一個(gè)接著一個(gè)的測(cè)讀。而攝像系統(tǒng)測(cè)讀一個(gè)樣品不需要預(yù)先知道它的位置，例如膜上的一個(gè)條帶。影像系統(tǒng)能夠把樣品的濃度和位置信息給出。

　　4、CCD影像系統(tǒng)能夠同時(shí)獲得大量樣品的信息。如對(duì)96、384或更多數(shù)目的微孔板的數(shù)據(jù)的同步收集并不是一個(gè)奢望。固態(tài)影像系統(tǒng)可以一次就獲得整個(gè)微孔板的影像和定量。

　　儀器設(shè)計(jì)者或終端使用者需要注意的是影像檢測(cè)器對(duì)于微孔板樣品的檢測(cè)存在一個(gè)重大的缺陷：三維的微孔板相比于二維檢測(cè)物(如膜)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)邊際效應(yīng)。因?yàn)楣鈴?qiáng)度按照距離平方的倒數(shù)逐漸變?nèi)?，所以把攝像頭放到盡可能離板近的地方由此可以得到的結(jié)果。然而，因?yàn)榭资怯猩疃?，zui遠(yuǎn)孔的整個(gè)底部就可能看不到。這個(gè)孔的邊緣部分的光信號(hào)就很可能檢測(cè)不到。

　　提高攝像頭將削減檢測(cè)器所獲得的整體的光強(qiáng)度。幾何計(jì)算模式可以拿來(lái)應(yīng)用以彌補(bǔ)邊際強(qiáng)度的丟失，但是外圍孔的信噪比必然比中央孔的要差。

　　CCD應(yīng)用zui普遍的設(shè)備系統(tǒng)為帶制冷CCD的化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)。為了提高檢測(cè)速度和通量，有時(shí)也把CCD應(yīng)用到高通量的板式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上。

　　固相樣品的檢測(cè)(印跡膜)

　　X光片——它已經(jīng)被認(rèn)為是對(duì)固定在膜上的蛋白或核酸進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具，如Southern、Northern和Western雜交的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。此類(lèi)商業(yè)化的產(chǎn)品已非常廣泛。

　　如果能夠控制好非特異性的結(jié)合，靈敏度是足夠的。如果不能很好控制，將會(huì)X光片上曝光過(guò)度。解決這個(gè)問(wèn)題的策略是減少結(jié)合的試劑的量，例如抗體或類(lèi)似物。曝光時(shí)間1到10分鐘通常是足夠顯現(xiàn)大多數(shù)的印跡。更長(zhǎng)的很少能提高信號(hào)/背景。

　　關(guān)于靈敏度相對(duì)的方面來(lái)講，未得到信號(hào)并不意味著分析物的不存在。任何一種光學(xué)用膜片都有一個(gè)強(qiáng)度閾值，在這個(gè)閾值之上銀顆粒的光化學(xué)轉(zhuǎn)化才能成功。否則會(huì)失敗，稱(chēng)之為“可逆失敗”。在實(shí)際操作中，化學(xué)發(fā)光信號(hào)低于閾值強(qiáng)度的結(jié)果僅是簡(jiǎn)單的沒(méi)有記錄。更長(zhǎng)時(shí)間的曝光也不能克服這個(gè)問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)一些方法來(lái)改進(jìn)，在曝光之前如把膜片放在氫氣和氮?dú)獾幕旌蠚怏w中預(yù)閃，即用低強(qiáng)度的光短時(shí)間的照射膜片，以提高光學(xué)顆粒的光子。

　　CCD成像技術(shù)——zui近，基于CCD的影像系統(tǒng)已成為化學(xué)發(fā)光印跡結(jié)果獲得和記錄的好工具。這些系統(tǒng)在信號(hào)測(cè)試的動(dòng)態(tài)范圍上表現(xiàn)出很好的效果。CCD的量度大小為3～4個(gè)級(jí)數(shù)，而X光片僅為1個(gè)級(jí)數(shù)。攝像時(shí)間短，并且可以獲得多個(gè)影像和容易存儲(chǔ)。雖然需要投入設(shè)備的購(gòu)置費(fèi)，但是可以節(jié)省膜片和其它的投入。

　　設(shè)備(光電倍增管)

　　在發(fā)光儀上，PMT為傳統(tǒng)的選擇。它們的優(yōu)勢(shì)包括良好的靈敏度，寬廣的動(dòng)態(tài)范圍和較寬的光譜相應(yīng)。因?yàn)镻MT具有很低的暗電流，使得它們具有的信噪比。

　　PMT有兩種基本模式——單光子計(jì)數(shù)和電流感應(yīng)。有些復(fù)合系統(tǒng)是在每秒百萬(wàn)個(gè)光子以下為單光子模式，超過(guò)之后為電流感應(yīng)。

　　PMT單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)是超靈敏的。用這類(lèi)檢測(cè)器主要是為了滿(mǎn)足靈敏度要求較高的測(cè)試和定量。越高要求的靈敏度，價(jià)格越高。樣品測(cè)試室必須是光密閉性非常好的。如果光太強(qiáng)會(huì)損害PMT。

　　PMT電流感應(yīng)系統(tǒng)也能獲得較好的靈敏度，經(jīng)常用于比單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)檢測(cè)的更強(qiáng)的光。

　　對(duì)于選擇何種模式的PMT檢測(cè)器，需要與你的實(shí)際需要結(jié)合起來(lái)選擇?，F(xiàn)在，這兩種檢測(cè)器的化學(xué)發(fā)光儀操作都比較簡(jiǎn)單，靈敏度也都比較好。對(duì)此有一個(gè)正確的理解，你就可以選擇一個(gè)比較適合你的應(yīng)用的設(shè)備。

　　PMT主要應(yīng)用在液相中化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)，儀器形式可以為管式和板式。其檢測(cè)結(jié)果單位值為RLU(Relative Light Unit)，各個(gè)公司生產(chǎn)的產(chǎn)品其對(duì)RLU的定義會(huì)有所不同。