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從分選到驗(yàn)證：CytoFLEX系列護(hù)航胰腺癌免疫治療創(chuàng)新研究
然而，傳統(tǒng)識(shí)別“腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞”（即能精準(zhǔn)識(shí)別并攻擊癌細(xì)胞的T細(xì)胞）的方法，主要依賴(lài)復(fù)雜、耗時(shí)的“新抗原”篩選，且許多有功能的細(xì)胞在體外難以擴(kuò)增，導(dǎo)致大量有效細(xì)胞被漏檢。
當(dāng)單細(xì)胞測(cè)序遇見(jiàn)深度學(xué)習(xí)
面對(duì)這些挑戰(zhàn)，一項(xiàng)由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院等團(tuán)隊(duì)聯(lián)合完成的研究，開(kāi)創(chuàng)性地整合了單細(xì)胞測(cè)序與深度學(xué)習(xí)技術(shù)，繞過(guò)了傳統(tǒng)的新抗原篩選步驟，直接、快速地鑒定出胰腺癌中的腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。研究還采用了TCR-T細(xì)胞殺傷類(lèi)器官模型與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，在功能與空間層面雙重驗(yàn)證了這些細(xì)胞的活性。
這種方法的核心優(yōu)勢(shì)在于大幅降低了識(shí)別腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的成本與時(shí)間門(mén)檻，為開(kāi)發(fā)新型T細(xì)胞療法開(kāi)辟了高效的新路徑。
CytoFLEX SRT奠定高質(zhì)量數(shù)據(jù)基石
高質(zhì)量的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)始于精準(zhǔn)的細(xì)胞分選。研究團(tuán)隊(duì)在這一關(guān)鍵步驟中選擇了CytoFLEX SRT流式細(xì)胞分選儀。在制備單細(xì)胞測(cè)序樣本時(shí)，研究人員使用PE標(biāo)記的抗人CD8抗體和DAPI對(duì)新鮮腫瘤組織制備的單細(xì)胞懸液進(jìn)行染色。CytoFLEX SRT憑借其卓越的性能，將高活力的CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞精準(zhǔn)分選出來(lái)，作為后續(xù)單細(xì)胞RNA和TCR測(cè)序的起始材料。
CytoFLEX SRT流式細(xì)胞分選儀確保了單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于高度純化的目標(biāo)細(xì)胞群，極大提高了后續(xù)生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。這是構(gòu)建高質(zhì)量單細(xì)胞圖譜和深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練集的關(guān)鍵第一步，為整個(gè)研究奠定了數(shù)據(jù)質(zhì)量基礎(chǔ)。
CytoFLEX分析儀提供關(guān)鍵功能證據(jù)
在功能驗(yàn)證階段，研究團(tuán)隊(duì)使用了CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀，進(jìn)行了兩項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)：
在構(gòu)建TCR-T細(xì)胞時(shí)，研究使用抗小鼠TCR β鏈抗體檢測(cè)外源TCR在患者自體T細(xì)胞中的表達(dá)率，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。這一步驟直接證實(shí)了深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)出的TCR能夠在T細(xì)胞上成功表達(dá)，為后續(xù)的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
圖2：TCR-T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤類(lèi)器官的細(xì)胞毒性作用
A：明場(chǎng)顯微鏡圖像顯示患者來(lái)源的腫瘤類(lèi)器官 (WY_04) 在不同代次 (P0, P2, P3, P5) 的生長(zhǎng)和形態(tài)變化。B：腫瘤組織和類(lèi)器官的免疫組織化學(xué)分析，顯示關(guān)鍵腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。C：腫瘤類(lèi)器官的多重免疫熒光分析，用于檢測(cè)特定腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。D：流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，轉(zhuǎn)染后第8天，患者自體外周血淋巴細(xì)胞中外源TCR基因的表達(dá)陽(yáng)性率。E：與TCR-T細(xì)胞共培養(yǎng)的類(lèi)器官的代表性共聚焦顯微鏡圖像，使用吖啶橙/碘化丙啶 (AO/PI) 染色以評(píng)估細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。Org：類(lèi)器官。non-TR TCR-T control：非腫瘤反應(yīng)性TCR對(duì)照組。F：與對(duì)照組 (Org & non-TR TCR) 相比，類(lèi)器官數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示出顯著差異 (Welch's t 檢驗(yàn): ** P<0.01; *** P<0.001)。G：TCR-T細(xì)胞與類(lèi)器官共培養(yǎng)的IFN-γ ELISA檢測(cè) (Welch's t檢驗(yàn): *** P<0.001)。
研究人員用JC-1染料對(duì)持續(xù)活化的正常供者來(lái)源的T細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)檢測(cè)紅色 (585 nm) 與綠色 (525 nm) 熒光信號(hào)的比例，定量分析線粒體功能狀態(tài)。分析結(jié)果顯示：持續(xù)激活超過(guò)72小時(shí)后，具有高膜電位的T細(xì)胞比例從超過(guò)70%下降到45%（圖4G）。這一在正常T細(xì)胞模型中觀察到的現(xiàn)象，為在腫瘤反應(yīng)性CD8+ T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的‘線粒體呼吸鏈相關(guān)基因下調(diào)’提供了重要的間接功能證據(jù)，支持了其可能存在代謝功能障礙的推論。
圖4：人胰腺癌中TR CD8? T細(xì)胞的生物學(xué)特征
A：差異表達(dá)基因分析展示了不同亞型TR CD8? T細(xì)胞中上調(diào)與下調(diào)的基因。DEG：差異表達(dá)基因。B：沖突圖展示了不同亞型TR CD8? T細(xì)胞在指定比較組之間重疊的GO通路。C：通過(guò)GSEA分析獲得的TR CD8? T細(xì)胞相較于非TR T細(xì)胞（耗竭型和效應(yīng)記憶型）轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因集的富集圖；p值通過(guò)單細(xì)胞GSEA的單尾置換檢驗(yàn)確定。NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)。D與E：韋恩圖展示了通過(guò)調(diào)節(jié)子分析，在來(lái)自四名患者（TIPC249/309、P15及P）的GZMK? Tem亞型TR CD8? T細(xì)胞中富集的FOS調(diào)節(jié)子?；鹕綀D顯示了TIPC309患者的TR CD8? T細(xì)胞中顯著上調(diào)的FOS (-) 調(diào)節(jié)子與顯著下調(diào)的FOS (+) 調(diào)節(jié)子。F：整合基因組學(xué)查看器截圖顯示了初始T細(xì)胞與活化5小時(shí)后的T細(xì)胞中線粒體位點(diǎn)的開(kāi)放染色質(zhì)狀態(tài)?？v軸顯示了經(jīng)比對(duì)讀數(shù)歸一化后的估計(jì)片段所覆蓋的ChIP-seq范圍。G：JC-1線粒體膜電位檢測(cè)顯示了T細(xì)胞持續(xù)活化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度。
該研究取得了系列重要發(fā)現(xiàn)
代謝特征：腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞普遍存在線粒體呼吸鏈功能受損，且受轉(zhuǎn)錄因子FOS調(diào)控。
新免疫檢查點(diǎn)：首次在胰腺癌中系統(tǒng)揭示了TIGIT-NECTIN2軸是腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)重要免疫抑制通路。
TCR特性：部分腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞攜帶多重TCR組合，且實(shí)驗(yàn)證明，組合使用多個(gè)不同的TCR比單一TCR具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力。
預(yù)后標(biāo)志物：研究證實(shí)，腫瘤組織中腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的比例越高，患者接受新輔助免疫治療的效果越好，總生存期也更長(zhǎng)，使其成為潛在的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。
可靠平臺(tái)，驅(qū)動(dòng)前沿發(fā)現(xiàn)
這項(xiàng)研究完美展示了從前沿科學(xué)問(wèn)題提出，到技術(shù)創(chuàng)新突破，再到嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的完整閉環(huán)。CytoFLEX SRT分選儀與CytoFLEX分析儀構(gòu)成的流式解決方案，貫穿了從“細(xì)胞精準(zhǔn)取材”到“功能深度解析”的全過(guò)程，是確保研究結(jié)論堅(jiān)實(shí)可靠的核心技術(shù)支柱。
在單細(xì)胞與人工智能驅(qū)動(dòng)的生物醫(yī)學(xué)研究新時(shí)代，流式細(xì)胞術(shù)作為連接“發(fā)現(xiàn)”與“驗(yàn)證”的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，其價(jià)值日益凸顯。貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)的CytoFLEX系列流式平臺(tái)，以其卓越的性能與可靠性，將持續(xù)為全球科研人員在腫瘤免疫、細(xì)胞治療等前沿領(lǐng)域的探索提供強(qiáng)大支持。
參考文獻(xiàn)：
Sun, H., Shi, C., Fang, G. et al. Functional tumor-reactive CD8?+?T cells in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res 44, 253 (2025). https://doi.org/10.1186/s13046-025-03517-1
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