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北京西美杰科技有限公司
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HCP ELISA方法驗(yàn)證——加標(biāo)回收（Spike & Recovery）
2024-12-26 閱讀(2608)
前言
在ELISA試劑盒的使用過程中，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了有效識(shí)別樣品配方與試劑盒組分之間的兼容性，加標(biāo)回收這一關(guān)鍵驗(yàn)證試驗(yàn)顯得尤為重要。它不僅是評(píng)估ELISA試劑盒準(zhǔn)確性的重要工具，也是滿足法規(guī)和藥典（如ICH或FDA指南等）對(duì)商品化ELISA試劑盒方法學(xué)驗(yàn)證要求的可靠方式。
什么是加標(biāo)回收？
加標(biāo)回收就是將已知量的標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中（“加標(biāo)”，spiking），通過對(duì)比加入前后的檢測結(jié)果，評(píng)估“回收”（recovery）測量值的準(zhǔn)確性。這一過程可以揭示樣品及其緩沖液中某些成分是否會(huì)干擾檢測結(jié)果。目前，影響ELISA試劑盒定量結(jié)果的常見因素包括pH、去污劑、有機(jī)溶劑、高蛋白質(zhì)濃度以及高鹽濃度等。因此，在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)之前，確保排除這些干擾因素是至關(guān)重要的。
如何判定干擾因素？
樣品或緩沖液中的某些成分可能會(huì)影響HCP或其他雜質(zhì)的檢測與定量，導(dǎo)致回收結(jié)果的高估或低估，由此說明樣品中存在干擾因素。同樣，上游收獲物和過程樣品的基質(zhì)中也可能存在疑似干擾 ELISA 檢測的成分。
在有干擾的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常表現(xiàn)為回收率偏低。但是，如果藥物本身或其他基質(zhì)組分與捕獲或檢測抗體有相互作用，則可能表現(xiàn)為回收率偏高。
此外，非特異性干擾，如試劑與孔板的結(jié)合，也會(huì)導(dǎo)致OD值偏高。通過合理控制實(shí)驗(yàn)流程，可以找出具體的干擾因素。
何時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)？
在進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)前，需要先完成樣品的稀釋線性分析，只有明確了最低需求稀釋倍數(shù)（MRD），加標(biāo)回收分析才有意義。（稀釋線性分析的詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參考《HCP ELISA方法驗(yàn)證——稀釋線性dilution linearity》）
（Tips：每種類型的樣品基質(zhì)都需要進(jìn)行加標(biāo)回收分析。同時(shí)如果實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了優(yōu)化，則需要重復(fù)此實(shí)驗(yàn)以確保檢測的有效性。）
如何執(zhí)行加標(biāo)回收分析？
樣品制備：
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加標(biāo)樣品：可以設(shè)定3-4個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到不同類型待檢樣品中，制備成加標(biāo)樣品，需要注意的是加標(biāo)樣品的濃度需在滿足MRD的條件下進(jìn)行分析，也就是最低加標(biāo)濃度不能低于LOQ的兩倍。
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對(duì)照樣品：按相同體積比在每種待檢樣品中加入樣品稀釋液，制備成對(duì)照樣品，用于測定樣品本底的HCP濃度。
實(shí)驗(yàn)過程：
使用ELISA試劑盒同時(shí)檢測加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品，每個(gè)樣品最好做3個(gè)重復(fù)孔，以計(jì)算均值。
結(jié)果分析：
回收率計(jì)算公式：
如下表案例所示，我們使用大腸桿菌HCP ELISA試劑盒（F410）分別檢測加標(biāo)樣品（100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品與樣品按1:4體積比混合，加標(biāo)濃度為20 ng/mL）和對(duì)照樣品（樣品稀釋液與樣品按1:4體積比混合），通過測得的HCP濃度計(jì)算出回收率為95%。
依據(jù)ICH、FDA及EMA等分析方法驗(yàn)證指南要求，HCP加標(biāo)回收率的可接受范圍應(yīng)在75%~125%。
為了方便您快速了解如何用4倍稀釋法制備加標(biāo)樣品和ELISA布板的詳細(xì)步驟，請(qǐng)觀看以下操作視頻。
加標(biāo)回收問題排查
如果加標(biāo)回收數(shù)據(jù)顯示出明顯的產(chǎn)物或基質(zhì)干擾，您可能需要通過進(jìn)一步稀釋樣品或置換緩沖液等方式來獲取準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。理想情況下，請(qǐng)選擇與標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液進(jìn)行樣品稀釋，這樣可以最大限度地減少偏差。在某些情況下，調(diào)整檢測方法也許能提高特定樣品類型的準(zhǔn)確性，但請(qǐng)務(wù)必謹(jǐn)慎操作，以免影響結(jié)果的可靠性。
為了全力支持客戶進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證及方法學(xué)開發(fā)，Cygnus為每款ELISA試劑盒都配備了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，詳情請(qǐng)查閱下表。
| 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 適用的試劑盒貨號(hào) |
| F553H-1 | CHO HCP Antigen Concentrate, 3G | 400 µl | F550-1 |
| F1048X | CHO Lysate HCP Antigen Concentrate | 200 uL | F1045 |
| F1023X | E. coli HCP 2G Antigen Concentrate | 200 uL | F1020 |
| F1063X | BL21(DE3) HCP Antigen Concentrate | 200 µl | F1060 |
| F653SX | HEK 293 Antigen Concentrate | 250 µl | F650S |
| F1043X | Sf9 HCP 3G Antigen Concentrate | 200 µl | F1040 |
| F1018X | P. pastoris HCP Antigen Concentrate | 200 µl | F1015 |
| F143U | P. pastoris Antigen Concentrate | 200 µl | F140/F640 |
| F978X | Vero Cell 2G HCP Antigen Concentrate | 400 µl | F975 |
| F1058X | PER.C6 HCP 2G Antigen Concentrate | 200 µl | F1055 |
| F1033X | SP2/0 HCP 2G Antigen Concentrate | 200 uL | F1030 |
| F998X | PG13 HCP Antigen Concentrate | 200 uL | F995 |
| F493G | L. lactis HCP Antigen Concentrate | 200 µl | F490 |
| F233G | A549 Antigen Concentrate | 200 µl | F230 |
| F813X | HeLa Antigen Concentrate | 1 ml | F810 |
| F803X | MDCK Antigen Concentrate | 1 ml | F800 |
| F513G | BHK HCP Antigen Concentrate | 1 ml | F510 |
| F227C | NS/0 Antigen Concentrate | 1 ml | F220 |
| F453X | P. fluorescens Antigen Concentrate | 1 ml | F450 |
| F823X | CAP® Antigen Concentrate | 400 µl | F820 |
| F1028X | C1 HCP Antigen Concentrate | 200 uL | F1025 |
| F603X | Protein A Antigen Concentrate | 250 µl | F600 |
| F613X | Protein A Antigen Concentrate | 250 µl | F610 |
| F403H | Protein A Antigen Concentrate | 200 µl | F400 |
| F044 | Protein A Concentrate | 200 µl | F050/F050H |
| F740-C | Amsphere™ A3 Ligand Protein A Control | 250 µl | F740 |
| F968X | Avantor J.T.Baker® BAKERBOND® PROchievA™ Protein A Antigen Concentrate | 250 µl | F965 |
| F743X | Amsphere™ A3 Ligand Protein A Antigen Concentrate | 300 µl | F740 |
| F1068X | Protein L Antigen Concentrate | 200 µl | F1065 |
| F963X | EndonucleaseGTP® Antigen Concentrate | 500 µl | F960 |
| F031G | BSA Antigen Concentrate | 1 ml | F030 |
雖然加標(biāo)回收可以驗(yàn)證HCP ELISA的準(zhǔn)確性，但這只是整體方法學(xué)驗(yàn)證的一部分。完整的驗(yàn)證過程仍需包括精密度、LOD、LLOQ、ULOQ和HCP抗體覆蓋率等分析。Cygnus針對(duì)每一種檢測試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或直接聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的過程中遇到任何問題，我們的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)將竭誠為您提供解決方案和建議。
Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家，其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用，并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。
北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理，與國內(nèi)眾多藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。北京西美杰是Cygnus代理，Cygnus中國代理，Cygnus北京代理，Cygnus總代理，Cygnus上海代理，，Cygnus西北代理，Cygnus西南代理，Cygnus東北代理，Cygnus華北代理，Cygnus華南代理，Cygnus華中代理，負(fù)責(zé)Cygnus在中國的相關(guān)業(yè)務(wù)。
