1．RNA的提取

　　RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，zui后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。

　　1．1分離高質量RNA

　　成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的zui大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

　　一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly（A）+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly（A）+RNA會增加檢測的靈敏度。

　　1．2RNA提取的zui大影響因素-RNA酶

　　在所有RNA實驗中，zui關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度很大。

　　在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要zui大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

　　1．3常用的RNA酶抑制劑

　　*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

　　*異硫氰酸胍：目前被認為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

　　*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態(tài)類物質，幾乎能*抑制RNA酶的活性。

　　*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

　　*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

　　1．4防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準備的工作

　　*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區(qū)，離心機、移液器、試劑等均應。RNA操作區(qū)應保持清潔，并定期進行除菌。

　　*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。

　　*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNaseH、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。

　　*關于一次性塑料制品，建議使用廠家供應的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。多數(shù)廠家供應的無菌塑料制品很少有RNase污染，買來后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。

　　*所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

　　*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。

　　*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應采用未開封的新瓶裝試劑。

　　*塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

　　*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。

　　*配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。

　　1．5RNA提取的一般步驟

　　RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

　　破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

　　分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。

　　沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。

　　洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。

　　保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。

　　1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

　　TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產(chǎn)量十分有用。

　　TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩(wěn)定保存12個月。盡管如此，為達到*效果，建議保存在2-8°C的環(huán)境下。

　　2．RT-PCR

　　RT-PCR是指將逆轉錄（ReverseTranscription；RT）反應和PCR（PolymeraseChainReaction）反應組合在一起的方法。

　　2．1RT-PCR的原理

　　RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。

　　RT-PCR的模板可以為總RNA或poly（A）+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo（dT）或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。

　　2．2RT-PCR的步驟

　　⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；

　　⑵70度水浴5分鐘，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；

　?、羌尤?×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP2uL（這些應該先配好，然后分再裝到每一管），混勻；

　?、?7度水浴5分鐘，加入1uLAMV-RT反轉錄酶，混勻；

　?、?7度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；

　?、?0度10分鐘結束反應（此處是滅活酶活性，避免對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾），產(chǎn)物置冰上進行下一步PCR實驗，余下的-70度保存。2．3RT-PCR的引物設計

　　RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：

　　*典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

　　*選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

　　*設計5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

　　*避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

　　*避免3'末端富含GC。設計引物時保證在zui后5個核苷中含有3個A或T。

　　*避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

　　*避免存在可能會產(chǎn)生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。

　　目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。

　　引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個月。

　　2．4引物退火溫度

　　引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

　　根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴謹?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

　　2．5提高逆轉錄保溫溫度

　　較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性后也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高于60℃時使用oligo（dT）和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，并加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助于防止較低溫度時所發(fā)生的分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。

　　2．6促進逆轉錄的添加劑

　　包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結構，zui多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受zui多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中zui大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產(chǎn)物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。

　　在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在*鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。

　　使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶：逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產(chǎn)物的大小受限于逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。RNaseH-的逆轉錄酶可以顯著提高長RT-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，同時增加了熱穩(wěn)定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。

　　2．7RNaseH處理

　　在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，據(jù)認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。2．8小量RNA檢測方法的提高

　　當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨后的沉淀。對于小于50mg的組織或106個培養(yǎng)細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。

　　2．9一步法同兩步法RT-PCR的比較

　　兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優(yōu)點。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易于操作，有助于減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，zui低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。對于成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。

　　2．10增加RT-PCR特異性

　　*鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。

　　隨機引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結構區(qū)域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA，需要按經(jīng)驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly（A）+RNA。

　　Oligo（dT）起始比隨機引物特異性高。它同大多數(shù)真核細胞mRNA3'端所發(fā)現(xiàn)的poly（A）尾雜交。因為poly（A）+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數(shù)量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo（dT）一般不需要對RNA和引物的比例及poly（A）+選擇進行優(yōu)化。建議每20μl反應體系使用0.5μgoligo（dT）。oligo（dT）12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScriptRT-PCRSystem提供了oligo（dT）20，因為其熱穩(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。

　　基因特異性引物（GSP）對于逆轉錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo（dT）那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'zui末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對于部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多于一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的*鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。

　　2．11提高逆轉錄保溫溫度

　　為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點，應該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉錄酶。熱穩(wěn)定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有*利用。然而某些特別的逆轉錄酶可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物。為獲得zui大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。

　　2．12減少基因組DNA污染

　　RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產(chǎn)生于基因組DNA的產(chǎn)物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mMEDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解。

　　為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產(chǎn)物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。