液相色譜儀_液相色譜法_液相色譜儀原理【百問百答】

1、什么是液相色譜儀？

液相色譜儀是一種采用分離與分析技術(shù)的儀器，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中．為了區(qū)分各種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。

2、液相色譜儀介紹

液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

3、液相色譜儀原理

液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。簡單的說，就是樣品溶解在流動相中，隨流動相進入色譜柱，經(jīng)過固定相（填料）時，會受到固定相的吸附。樣品中不同組分受到的吸附不同，于是流譜柱的時間順序就不同。

如果是反相色譜，固定相（硅膠烷烴填料)極性 小于 流動相(乙腈、甲醇等溶液）。樣品中的各組分，極性小的受到的固定相吸附力就比較大，較晚流譜柱，體現(xiàn)在譜圖中及出峰較晚。

正相色譜則相反。

HPLC是高壓輸送流動相，快速、分離的液相色譜法。

（通常用的多的是第二種，即分配平衡，）色譜分離原理
液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
（1）．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
（2）．液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、Tetrahydrofuran、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、Tetrahydrofuran等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
（3）．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
（4）．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。
分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、Three FLUOROACETIC acid 也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈。

4、液相色譜儀的作用

主要是用于定量組分分析用，簡單的說，就是能能準確的知道單位體積內(nèi)含有多少某一種或某幾種物質(zhì)的量，也能比較準確的分析混合物中含有那些物質(zhì)或那一類物質(zhì)。

液相色譜儀應(yīng)用很廣泛，基本能對有機化合物中百分之七十到百分之八十的化合物進行分離與檢測，下面以液相色譜技術(shù)做為舉例：
應(yīng)用
液相色譜用途廣泛，已經(jīng)成為大多數(shù)化學(xué)行業(yè)和生命科學(xué)行業(yè)中的標準配置。液相色譜和液－質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)正為各種客戶群服務(wù)，如藥物研制和生產(chǎn)、蛋白質(zhì)、食品安全、環(huán)境、國土安全和石油化工等市場。隨著新應(yīng)用和改進應(yīng)用的開發(fā)，液相色譜的市場增長很快，包括制藥和生命科學(xué)市場，中國和印度增長勢頭尤為強勁。

制藥：制藥行業(yè)是液相色譜儀和液－質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的主要用戶。從藥物研制到開發(fā)、制造和QA/QC，液相色譜在藥物的整個生命周期中發(fā)揮著重要作用。它使得科學(xué)家能夠迅速進行篩選、純化的分析工作。液相色譜和液－質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)也是用來檢查藥物化合物質(zhì)量和數(shù)量的主要工具，它在法規(guī)環(huán)境中使用固定方法，為藥物制造提供支持。

蛋白質(zhì)：液相色譜和液－質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)正在不斷增長的一個市場機會是識別、隔離和凈化細胞和體液中的蛋白質(zhì)。液相色譜用途廣泛，為分析蛋白質(zhì)和其它生物分子提供了理想的技術(shù)，包括大的、非常靈敏、分析困難的蛋白質(zhì)和生物分子。

環(huán)境：的客戶主要是重點滿足和實施法規(guī)標準的政府實驗室、工業(yè)實驗室和獨立實驗室。液相色譜和液－質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析包括非揮發(fā)性殺蟲劑、除草劑、多核芳香碳氫化合物及不適合氣相色譜的其它化合物。

食品安全：食品安全分析包括檢測農(nóng)產(chǎn)品和食品中的添加劑、殘留物、雜質(zhì)和毒素，其主要重點是滿足和實施法規(guī)標準。在貿(mào)易自由化、法規(guī)監(jiān)管環(huán)境不斷完善及食品安全問題的公眾意識不斷提高的情況下，食品分析需求正在迅速增長。

法律醫(yī)學(xué)：科技是用于藥物篩選和毒理學(xué)研究的氣相色譜/質(zhì)譜儀系統(tǒng)的領(lǐng)導(dǎo)型供應(yīng)商。作為氣相色譜/質(zhì)譜設(shè)備的補充，的液相色譜/質(zhì)譜系統(tǒng)已開始被應(yīng)用于法醫(yī)分析。電感耦合離子質(zhì)譜與激光切除的結(jié)合對于法醫(yī)調(diào)查中固體樣品以及基本元素圖譜的測量也非常有效。

國土安全：長期以來一直與美國和政府、軍事、司法和衛(wèi)生機構(gòu)合作，檢測、識別、確認和消除生物和化學(xué)戰(zhàn)爭制劑及有毒的工業(yè)化合物。

石油化工(HPI)：液相色譜儀應(yīng)用包括添加劑化驗、精細和化學(xué)分析以及使用帶有有機溶劑或水性溶劑的大小排查色譜檢定聚合物。

半導(dǎo)體：為半導(dǎo)體制造過程中超高純度材料的分析提供了的創(chuàng)新型和高可靠型電感耦合離子質(zhì)譜儀。電感耦合離子質(zhì)譜儀的主要應(yīng)用包括半導(dǎo)體制造過程中散裝和過程化學(xué)品的特性分析、硅片表面有機及金屬污染物分析、終部件（磁盤驅(qū)動器，電路板等）制造過程中揮發(fā)性有機溶劑的分析。

5、液相色譜儀操作步驟

（1）、過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 （2）、對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。 （3）、打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。 （4）、進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。 （5）、有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10ml/min。 （6）、調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。 （7）、設(shè)計走樣方法。點擊file，選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊newmethod。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。 （8）、進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。 （9）、關(guān)機時，先關(guān)計算機，再關(guān)液相色譜。 （10）、填寫登記本，由負責(zé)人簽字。

6、使用液相色譜儀注意事項

 （1）、流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。 （2）、柱子是非常脆弱的，次做的方法，先不要讓液體過柱子。 （3）、所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。 （4）、壓力不能太大，不要超過2000psi

7、液相色譜儀價格：

1290 Infinity II 液相色譜儀

參考成交價格： 11.2萬元[美元]

, 效率優(yōu)先，大化分析效率、儀器效率、實驗室運營效率

ACQUITY Arc UHPLC超液相色譜儀

參考成交價格： 8.98萬元[美元]

沃特世, 四元溶劑管理UHPLC，HPLC和UHPLC方法切換簡單，幫助用戶從HPLC過渡到UPLC

Vanquish flex UHPLC超液相色譜儀

參考成交價格： 8萬元[美元]

賽默飛, 四元泵，耐壓15000psi高流速達8mL/min，控溫準確，增加熒光檢測器

Nexera UC 在線SFE/SFC色譜系統(tǒng)

參考成交價格： 11.52萬元[美元]

島津, 是LC，GC & SFC 等分析模式統(tǒng)一的新技術(shù)，同時也是樣品制備和分離統(tǒng)一的新技術(shù)

iChrom5100系列液相色譜儀

參考成交價格： 15~25萬元[人民幣]

依利特, 高集成度的ARM微控制器及SPI、I2C總線技術(shù)，靈活實現(xiàn)LAN及RS485通訊方式

LC-100plus 二元高壓液相色譜儀

參考成交價格： 7.65~10.85萬元[人民幣]

伍豐, 數(shù)字化電腦智能全控，穩(wěn)定，方便，外觀新穎

8、液相色譜儀常見故障分析

故障1：流動相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵，打開排空閥，按PURGE鍵清洗脫氣，氣泡不斷的從過濾器冒出，進入流動相，無論打開PURGE鍵幾次，都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。
原因：
過濾器長期沉浸于水液內(nèi)，過濾頭內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢的通過過濾頭，空氣在泵的壓力下經(jīng)過過濾器進入流動相.處理過濾頭浸泡在5%的硝酸溶液內(nèi)，超聲清洗十五分鐘即可；亦可將過濾頭浸泡在5%的硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開排空閥，打開PURGE鍵清洗脫氣如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡在5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器冒出,說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團以被硝酸破壞,流動相可以流暢的通過過濾器，打開排空閥，打開泵流速調(diào)治1.0～3.0mL/min，純水沖洗過濾器1小時左右，即，可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。
故障2：柱壓高；
原因：
(1)緩沖液鹽份如，乙酸銨等，沉積柱內(nèi)；
(2)樣品污染沉積：
處理對于種情況先用40～50度的純水，低速正向沖洗柱子待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)的提高流速沖洗柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘，對于第2種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇[4+6]沖洗柱子[沖洗時間的長短由樣品的污染情況而定]，在用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，后甲醇沖洗，正向沖洗柱子30分鐘以上。

故障3：既無壓力指示又無液體流過

　    原因：

　　1.泵密封墊圈磨損；

　　2.大量氣體進入泵體：

　　處理對于種情況,更換密封墊圈，對于第二種情況,在泵作用的同時，用一個50mL的玻璃針筒在泵的出口處不幫助抽出空氣。

　　故障4：壓力波動大，流量不穩(wěn)定。

　　原因：

　　系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間家有異物，使得兩者不能密封；

　　處理：工作中注意流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣，如，為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。

　　故障5：出峰不準，峰分叉。

　　原因：

　　(1)色譜柱被污染；

　　(2)柱頭填料塌陷：

　　處理對于種情況,先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗，然后，再用純水沖洗，后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上，如，沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷，去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與助內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。

　　故障6：峰面積重復(fù)性不佳。

　　原因：

　?。?）進樣閥漏夜；

　?。?）加樣針不到位：

　　處理：

　　對于種情況更換進樣墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速，平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進樣量的準確。日常生活中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內(nèi)的溶液如時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖溶液要用純水沖洗干凈，防止無機鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，*溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜住的使用壽命，同時，避免注射過量濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜住作好標記，用于不同分析目的的色譜住不要混用等。

　　上文的知識就是小編為大家分享的液相色譜儀原理與用途、特點與故障原因及處理方法，希望大家可以有所收獲。液相色譜儀在使用的過程中會出現(xiàn)很多的問題，如果操作者可以了解故障的原因，就可以很好的去預(yù)防和排除這些故障，并且可以為正確使用該儀器使其發(fā)揮出大的性能。

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