“傳統(tǒng)冷凍工藝一般需將凍干機擱板溫度降至產品大凍干濃縮物的玻璃化轉變溫度之下，并維持設定時長，直至產品固化。這種僅使擱板溫度達到固化狀態(tài)的傳統(tǒng)方式，會造成冰晶成核隨機化、冰晶生長不均勻以及不同小瓶間干燥速率出現差異。此外，傳統(tǒng)擱板梯度冷凍法還存在明顯的過冷現象。過冷度指的是平衡凍結點與冰晶成核溫度（T??）之間的差值。過冷程度越高，冰晶越小，進而致使主干燥階段冰升華界面上方干燥層中的空氣孔隙越小。因此，傳統(tǒng)冷凍工藝會使干燥層對氣流的阻力增大，從而延長主干燥時間。并且，傳統(tǒng)方法中較小的冰晶會使產品表面積增大，進而增加生物分子向表面遷移和吸附的風險。對于易發(fā)生表面降解的生物制品而言，這種傳統(tǒng)隔板梯度冷凍法可能會加劇蛋白質聚集問題。"

控制冰晶成核技術（CIN）

為解決上述問題，制藥行業(yè)已研發(fā)出控制冰晶成核技術（CIN）。這一新興技術能夠有效消除冷凍過程中冰晶的隨機成核現象，為藥品凍干工藝提供了新的解決途徑。

通常情況下，成核溫度越高，形成的晶體越大，升華的阻力越小，干燥的效率越高。然而，美國FDA的一篇發(fā)表在《Journal of Pharmaceutical Sciences》上的文章指出，較高的成核溫度并不一定能提升工藝效率。該文章探討了受控冰核（CIN）冷凍干燥工藝中成核溫度、工藝效率與產品質量之間的復雜關系，并通過多種分析技術揭示了其內在機制。小編在這里提煉和整理了相關的內容信息，以供大家參考。

1 研究方法

凍干工藝設計

研究采用5%蔗糖溶液作為測試配方，通過加壓-減壓技術實施連續(xù)冰核（CIN）工藝。實驗設置包括CIN-5℃、CIN-7℃、CIN-10℃和無控制冰核（NOCIN）四種模式。預凍階段中，凍干隔板溫度以1℃/min降至5℃并保持30min，隨后通過氬氣將腔室壓力升至28PSIG，再降溫至目標溫度。產品在設定溫度下保持1h后，迅速降壓誘導冰核形成，最終降至-40℃完成固化。一次干燥在-32℃的隔板溫度和50mTorr的腔室壓力下進行，二次干燥則在30℃的隔板溫度和200mTorr的壓力下完成。另外，NOCIN、CIN-5℃和CIN-7℃的凍干過程重復進行，但一次干燥條件較為嚴苛（-25℃的隔板溫度和50mTorr，即66.66μbar壓力），同時保持與之前相同的預凍和二次干燥工藝參數。在每個凍干循環(huán)后，對西林瓶進行壓塞密封，并目視檢查是否存在肉眼可見的塊狀物塌陷。

在線與離線監(jiān)控

使用36號T型熱電偶監(jiān)測產品溫度，Lyoflux200™水蒸氣質量流量監(jiān)測儀實時記錄一次干燥和二次干燥過程中的水蒸氣質量流量。通過壓力差法確定干燥終點，并利用公式R?=A?(P??? -P?)/dm/dt????估算產品阻力。此外，AccuFlux™熱流傳感器用于評估冷凍保持時間的充分性，調頻光譜頂空壓力與水分分析儀檢測樣品瓶中的水活度。

高分辨顯微計算機X線斷層掃描（Micro-CT）三維成像及人工智能圖像分析

采用蔡司Versa 520 XRM系統(tǒng)對凍干餅進行高分辨率成像，采集約1000張二維橫截面圖像重建三維結構。圖像分析使用DigiM I2S軟件，結合人工智能技術對蛋糕固體與氣孔進行分割和量化分析，評估孔隙率、氣孔分布及固體壁厚等參數。

汞侵入孔隙度測定

采用AutoPore V 9600水銀孔隙度儀測定。水銀侵入法孔隙度測試在1-6000 PSIG的壓力范圍內進行，采用階梯式壓力遞增法。測試時采用130°接觸角，并根據室溫調整水銀密度。

掃描電子顯微鏡

對凍干餅的形態(tài)進行定性評估，切片樣品經濺射鍍金后，在10kV電壓和200倍及400倍放大倍數下進行成像。

2 結果與分析

01 冰核形成與工藝效率

圖1：預凍階段熱電偶（TC）溫度讀數顯示：(A)隨機冰核形成（NO CIN）與受控冰核形成過程在(B)-5℃（CIN-5℃）、(C)-7℃（CIN-7℃）及(D)-10℃（CIN-10℃）

圖2：一次干燥過程 (A)質量流量曲線和 (B)差壓讀數（Pirani和電容壓力讀數）對于 NOCIN、 NOCIN 加退火、CIN-5℃ 、CIN-7℃和CIN-10℃工藝。(C) CIN-7℃ 、CIN-5℃和 NOCIN在一次干燥步驟中干燥層阻力與干燥層厚度關系圖。(D) CIN-7℃ 、CIN-5℃和 NOCIN 產品的孔體積分布。

● 圖1展示了采用加壓-減壓控制冰核形成技術時凍結階段的溫度分布曲線以及傳統(tǒng)隨機成核（即未使用CIN）的溫度曲線。在冷凍階段使用受控成核導致所有監(jiān)測樣品瓶中同時發(fā)生成核現象。CIN-5℃、CIN-7℃、CIN-10℃和NOCIN的平均TIN值分別為：-3.4℃、-5.4℃、-8.6℃和-14.7℃。CIN工藝引發(fā)的冰核形成過程幾乎同步，各樣品瓶的成核起始時間僅相差不到一分鐘。相比之下，無CIN工藝的冰核形成過程耗時20min，T??值差異超過7℃ 。

● 圖2A顯示穩(wěn)態(tài)下質量流量隨CIN溫度的變化規(guī)律依次為：CIN-10℃≥CIN-7℃>CIN-5℃>NOCIN。CIN-10℃ 、CIN-7℃ 、CIN-5℃和NOCIN的平均穩(wěn)態(tài)質量流量分別為14.24g/h、14.21g/h、12.29g/h和10.53g/h。根據TDLAS質量流量曲線計算得出的對應一次干燥時間分別為：NOCIN、CIN-5℃ 、CIN-7℃和CIN-10℃的71h、54h、47h和47h。 

●通過皮拉尼差壓計和電容式壓力計（PG/CM）曲線分析得出不同CIN溫度下一次干燥時間分別：CIN-10℃≤CIN-7℃＜CIN-5℃＜NOCIN（圖2B），該規(guī)律與圖2A質量流量曲線觀測結果一致。

● T??與R?之間兩者呈反比關系。NOCIN工藝表現出高的產品阻力，其次是CIN-5℃，最后是CIN-7℃ 。

● 通過汞侵入孔隙度分析獲得的凍干餅的孔隙率分析（圖 2D）支持了CIN工藝中T??與R?之間的反比關系。與相應的CIN-7℃產品相比，CIN-5℃凍干產品的空氣孔隙更小。CIN-7℃和CIN-5℃產品的空氣孔隙尺寸分別為68.5±1.6μm和30.61±4.07μm 。出乎意料的是，測試的NOCIN 產品的空氣孔隙大于CIN-5℃產品。NOCIN產品的中位空氣孔隙為68.1±1.9μm。

02 熱流密度與固化時間

圖3：產品冷凍過程中的熱流密度與產品溫度分布曲線 (A)附圖示例的無CIN (B) NO CIN (C) CIN-7℃及 (D) CIN-5℃

● 熱流密度監(jiān)測顯示NOCIN工藝表現出明顯的“衰減"特征，而CIN工藝則呈現單一成核事件，表明CIN工藝能有效減少成核異質性。

● T??與完成固化所需的最短保持時間存在間接關系。NOCIN、CIN-7℃和CIN-5℃工藝的最短保持時間分別為110min、62min和48min。

03 水活度

圖4：(A) NO CIN 、(B) CIN-5℃及(C) CIN-7℃產品的部分水蒸氣含量與總頂空壓力；(D) 邊緣與中心小瓶的平均含水量。

● 不同工藝制備的凍干小瓶間部分蒸氣壓的差異，可能源于水活度的差異。此外， 同一批次內水活度的變化常被用作衡量產品質量同質性和批次間一致性的指標，進而作為判斷CIN工藝成敗的標準；

● 產品水活度呈現與T??的相關性：CIN-5℃工藝產品水活度高，其次為CIN-7℃和NOCIN工藝；

● CIN-7℃工藝的凍干制品在水分活性方面表現出高的異質性。NOCIN、CIN-5℃和CIN-7℃工藝的頂空部分蒸汽壓相對標準偏差分別為3.98%、2.37%和21.47%；

● 采用CIN工藝未必能改善所有產品質量屬性的異質性。

04 結構形態(tài)及孔隙分布

圖5：NOCIN整個餅狀結構的低分辨率（22μm ）顯微CT圖像和微塌陷區(qū)域的高分辨率（2μm） 圖像（從左至右：粉餅縱向橫截面靠近瓶壁中部和遠端）

圖6：完整 NOCIN 、CIN-5℃和CIN-7℃產品的高分辨率（2μm）顯微CT圖像（上：原始圖像；下：AI分割圖像） 。 圖像的灰色部分為蛋糕固體壁，而黑色和綠色部分為空氣空隙。圓圈顯示了微觀蛋糕塌陷的片段

圖7：完整 NOCIN 、CIN-5℃和CIN-7℃產品的模擬氣孔大小分布。(A)正常和(B)對數-對數圖

● 圖5證實了粉餅壁變形和微觀餅狀結構塌陷，并且來自三個不同樣本的顯微CT圖像，縱向切片（近側、蛋糕中部和遠側）顯示凍干NOCIN產品在高度和寬度方向上均存在高比例的微觀結構變化；蛋糕中部的微觀結構變化更為顯著；

● 圖6展示了NOCIN、CIN-5℃和CIN-7℃工藝代表性完整蛋糕的原始及AI分割高分辨率微CT圖像。NOCIN和CIN-7℃工藝代表性產品的高分辨率微CT圖像顯示粉餅壁變形，表明冷凍后存在微觀結構變化。而采用CIN-5℃工藝獲得的蛋糕微CT圖像則未顯示可見的粉餅壁變形跡象。NOCIN、CIN-7℃和CIN-5℃工藝生產的粉餅的孔隙體積分數分別為90.6% 、90.3% 和85.8% ；

● 人工智能分割圖像與模擬結果顯示，NOCIN產品的孔隙率和微觀結構存在顯著的批內和批間異質性。然而，通過 CIN-5℃和CIN-7℃工藝制備的代表性產品批內和批間異質性較低（圖7A&B）

05 激進工藝的產品外觀

圖8：（A）Pirani和電容式壓力計在中度激進工藝（Tshelf-25 °C）過程中的壓力讀數（B.）中度激進工藝后NOCIN、CIN-5℃和CIN-7℃產品的外觀，顯示NOCIN中肉眼可見的宏觀塌陷跡象。(C) NOCIN產品的放大圖像，證實肉眼可見的蛋糕塌陷

● 圖8展示了采用中度激進的凍干工藝后的PG/CM圖譜及最后凍干產品的外觀形態(tài)；

● 除了一次干燥隔板溫度外，其余的工藝參數均與前期保守工藝保持一致；

● 盡管CIN-7℃工藝的T??較低，但其一級干燥效率（約1.5倍）高于相應的CIN-5℃工藝；

● 工藝效率順序為CIN-7℃→CIN-5℃→NOCIN；

● 在NOCIN產品中觀察到進一步的肉眼可見的宏觀塌陷跡象，而在CIN-5℃和CIN-7℃工藝的產品中未觀察到（圖8B&C）。

從常規(guī)認知角度而言，較高的T??通常與粗大冰晶結構存在關聯，這種結構會降低一次干燥過程中的質量流動阻力，進而縮短一次干燥時長。然而，本研究表明，相較于采用較高T??值（CIN-5℃ ，T?? -3.5±0.5℃）的工藝，采用較低T??且更高過冷度的CIN工藝（CIN-7℃ ，TIN -5.4±0.5℃； CIN-10℃）中，T??值為-8.6±0.6℃的工藝具備更高的質量流率和更短的初始干燥時間。產品電阻隨時間的變化趨勢亦顯示，采用較低T??值和更高過冷度的CIN工藝（尤其是CIN-7℃和CIN-10℃）在一次干燥階段呈現出顯著更低的干燥層阻力。此外，掃描電子顯微鏡（SEM）和汞侵入孔隙度分析結果顯示，CIN-7℃和CIN-10℃工藝所制得的產品相較于CIN-5℃工藝的產品具有更大的空氣孔隙。 

為深入探究 CIN 工藝中TIN 與一次干燥效率異常關聯的根源，研究團隊提出如下三個假設：

（1）冰核形成后的冷凍保持時間不足為主要致因；

（2）CIN工藝未能同步誘導所有小瓶形成冰核可能是誘發(fā)因素；

（3）冷凍步驟后微觀結構的改變導致了所觀察到的較大氣孔體積及相應的工藝效率問題。

01

一假設驗證

借助熱流密度監(jiān)測儀開展研究，結果顯示T??與固化所需最短時間存在間接關聯，此關聯可能源于T??值升高致使的冷凍速率降低、冰晶尺寸增大以及凍結產物比例提高。值得注意的是，熱流密度監(jiān)測儀預測的所有工藝最短保持時間，均低于本研究采用的120min標準值。故而，T??與質量流率和一次干燥時間之間的異常關系，不能歸咎于產品在冷凍步驟中的不固化。

02

第二假設驗證

當前，業(yè)界尚未形成被廣泛認可的、可用于生產的無損監(jiān)測技術以證實CIN工藝的成功。本研究運用頂空部分壓力分析法對產品進行檢測，并將其作為驗證CIN工藝成敗的指標。本研究假設，成功的CIN工藝應能夠同步誘導所有小瓶形成冰核，進而確保水活度等產品質量屬性的高度一致性?；诖?，本研究對同一批次所有小瓶的水活度進行無損檢測，并以水活度的相對標準偏差（RSD）作為衡量CIN工藝成敗的標準。

研究結果出乎意料，CIN-7℃工藝的水活度異質性高（21.47%），而NOCIN產品未出現該現象。CIN-7℃工藝小瓶中水活度的較高異質性和雙峰分布，可能是由于盡管在冷凍步驟中同時誘導了冰核形成，但T??的分布范圍較廣。CIN 工藝雖能使所有小瓶同時形成冰核，但在CIN過程中并未直接控制產品溫度。因此，即便對于CIN工藝而言，也存在T??的固有分布，盡管其分布范圍比NOCIN 工藝更小。CIN-5℃和CIN-7℃工藝對應的 T??范圍分別為-3.5℃至-4.2℃和-4.4℃至-6.8℃。CIN-7℃工藝中 TIN 高于平均水平的小瓶，可能產出與CIN- 5℃工藝相當水活度水平的產品；另一方面，CIN-7℃工藝中 T??較低的小瓶，其水活度水平與 NOCIN 產品相當。盡管如此，CIN-5℃工藝產品水活度的低相對標準偏差（RSD）表明，該工藝成功實現了CIN誘導。由此可見，CIN工藝中T??與生產效率之間出現的異常相關性，不能歸因于CIN工藝的失敗。此外，NOCIN與CIN-5℃工藝的水分活度相對標準偏差（RSD）具有可比性，這表明產品質量的均勻性可能并非全取決于冷凍過程中的 T??差異。 由此可見，對于水分活度等產就產品質量指標而言，運用相對標準偏差百分比（%RSD）而非T??的波動幅度，可能更精準地衡量同批次產品質量的均勻性。

03

第三假設驗證

冷凍步驟之后的微觀或宏觀結構變化，或許是致使T??、一次干燥質量流量與時間之間存在間接關聯的因素。傳統(tǒng)上，掃描電子顯微鏡（SEM）和汞孔隙率分析被應用于凍干餅的微觀結構分析。然而，SEM分析過程中的樣本處理可能會引發(fā)微觀結構的改變。此外，凍干餅的某些微觀結構特征可能無法通過SEM和汞孔隙率分析檢測出來，因此本研究采用完整的高分辨率（2μm）微計算機斷層掃描成像技術，并結合人工智能分析技術，對凍干產品的微觀結構展開研究。高分辨率微CT成像結合AI圖像分析技術，揭示了傳統(tǒng)汞孔隙度測定法和掃描電子顯微鏡（SEM）無法解析的凍干餅微觀結構特征。微CT圖像顯示，采用NOCIN工藝和CIN-7℃工藝生產的凍干餅存在壁面變形現象，而CIN-5℃工藝產品則未出現此類狀況。此外，NOCIN工藝產品具有較大的氣孔，可能源于微觀結構坍塌時細孔的聚結現象。同樣地，CIN-7℃工藝產品及部分NOCIN產品氣孔的D90值（中位孔徑）高于CIN -5℃工藝產品，這可能是由于微觀結構坍塌時較小氣孔聚結形成更大孔隙所致。較低的過冷度與更高的蒸發(fā)冷卻效果、更低的初級干燥產物溫度以及更低的產品塌陷風險相關。這或許能夠解釋為何在CIN-5℃工藝的產品中未觀察到微觀塌陷現象，而CIN-7℃和NOCIN工藝的產品卻存在微觀塌陷跡象。此外，NOCIN工藝與大多數CIN-7℃工藝產品水活度的高度相似性，進一步支持了NOCIN和CIN-7℃工藝在冷凍步驟后可能發(fā)生微觀結構變化的可能性，而CIN-5℃工藝則未出現這種情況。

上述結論得到了NOCIN產品宏觀結構坍塌明顯跡象的佐證，而CIN-5℃和CIN-7℃產品則未出現類似情況。在中等激進凍干工藝中，隨著凍干隔板溫度的升高（進而導致產品溫度上升），微觀結構變化程度加劇，最終使NOCIN產品發(fā)生宏觀結構坍塌。研究再次表明，在中等激進凍干工藝過程中，CIN工藝的T??與一次干燥的升華速率及時間存在間接關聯。通過對穩(wěn)態(tài)的一次干燥和時間進行評估，得出工藝效率排序為：NOCIN、CIN-7℃、CIN-5℃。 

3 結論

在實際的凍干工藝開發(fā)、監(jiān)測與控制中采用工具面臨諸多挑戰(zhàn)。人工智能分析與高分辨率三維成像技術的應用，結合在線離線工藝分析技術，可能促進諸如CIN等技術的采用。對于CIN工藝而言，冷凍步驟后的微觀結構變化可能改變冰晶成核溫度、工藝效率與產品質量屬性之間的關系。即使在冷凍過程中盡努力降低冰晶成核溫度的波動，微觀結構變化仍可能影響產品質量屬性的均勻性。為提高一次干燥效率并實現更優(yōu)的產品均一性， 除需提高冰晶成核溫度和同步誘導冰晶成核外，還需對凍干工藝各步驟進行穩(wěn)健的工藝設計。

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